РАЗДЕЛЕНИЕ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТИЛАЦЕТАТА. СОСТАВ ЛИПИДОВ, ОТДЕЛЯЕМЫХ ИЗ ВОДНОГО ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЧАГИ ЭТИЛАЦЕТАТОМ М.А. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова, В.С. Гамаюрова, Э.Ф. Зайнетдинова Казанский государственный технологический университет, ул. К. Маркса, 68, Казань, Республика Татарстан

Статья посвящена исследованию нейтральных и полярных липидов водных извлечений, полученных из различных образцов сырья чаги. Липиды из водных извлечений чаги экстрагировали этилацетатом. В этилацетатном слое в свободном состоянии определены нейтральные и полярные липиды различных классов. В эмульсионном слое, образуемом при обработке водных извлечений чаги этилацетатом, липиды находятся в связанном состоянии с полифенолоксикарбоновым комплексом (ПФК). Для их изучения был применен щелочной гидролиз. Определен состав жирных кислот. Для проведения исследований применялись тонкослойная хроматография (ТСХ) и газожидкостная хроматография (ГЖХ). Установлены сходство и различия состава липидов, находящихся в свободном и связанном состоянии, а также проведено их сравнение в объектах исследования, полученных из различных образцов сырья.

Введение. Химический состав чаги исследован достаточно подробно [1]. Проанализированы эфирные и ацетоновые извлечения гриба на присутствие веществ кислого, основного, фенольного характера и нейтральных веществ. Спиртовые извлечения чаги проанализированы на присутствие среди неомыляемых веществ терпенов и стеринов [2]. Было показано, что чага, относящаяся к грибам-возбудителям белой гнили, как и другие грибы этого вида, синтезирует мало стеринов по сравнению с грибами-возбудителями бурой гнили. Неомыляемые вещества в количестве 0,85–0,94% от сухого веса гриба хроматографировали на колонке с Al2O3. Анализ этой фракции показал, что ее состав неоднороден и содержит смесь различных стеринов и терпенов – 0,04–0,13% от сухого веса гриба.
Основным компонентом дисперсной фазы коллоидной системы водного извлечения чаги является сложный ассоциат – полифенолоксикарбоновый комплекс (ПФК) [3].
В гидролизате полифенольного комплекса, полученного при применении в экстракции чаги ультразвука, определено содержание карбоновых кислот – 6,64% [4]. С помощью ГЖХ были идентифицированы высшие жирные кислоты, как нормального (н-С10, н-С12, н-С14), так и изостроения (i-С13, i-С15).

При длительном настаивании в воде при 70 ºС, т.е. в условиях получения водного извлечения чаги, в настой могут переходить липиды различной структурной организации [5]. Ранее липидный состав водной вытяжки чаги не исследовался.

Цель исследования – определение и сравнение качественного состава нейтральных и полярных липидов, отделяемых этилацетатом из водных извлечений чаги, полученных из различного сырья.

Экспериментальная часть. Для экстракции использовали сырье чаги, приобретенное в аптечной сети. Красногорский район, далее обозначаются как первый образец сырья и второй образец сырья соответственно. Вытяжки получали согласно методике [6].

Выделение липидов проводили экстракцией водной вытяжки чаги этилацетатом согласно методике [7]. Качественный состав липидов анализировали методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Sorbfil» в следующих системах растворителей: петролейный эфир – диэтиловый эфир – уксусная кислота (90 : 10 : 1 для нейтральных липидов) и хлороформ – метанол – 28% аммиак (65 : 25 : 5 для полярных липидов). В качестве проявителей применяли 20% раствор сульфата аммония и раствор хлорного железа (стерины и их эфиры) [8].

Щелочной гидролиз фракций липидов проводили метанольным 1 и 10% раствором гидроокиси калия при температуре 60 °С. Липофильные вещества экстрагировали из гидролизатов петролейным эфиром (40–60 °С).

Жирнокислотный состав липидов устанавливали методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Жирные кислоты анализировали в виде их метиловых эфиров на хроматографе «Шимадзу–GC-8A» с плазменноионизационным детектором с использованием насадочной колонки (2,0 м ×2,5 мм), заполненной с 5% ДЭГА(Р) на Chromaton N-super в режиме программирования температуры. В качестве газа-носителя применяли гелий со скоростью потока 30 мл/мин. Идентификацию кислот проводили сравнением относительных времен удерживания их метиловых эфиров по отношению к стандарту (18920 – LAMP).

Обсуждение результатов. Экстракция водного извлечения этилацетатом приводит к образованию трех слоев этилацетатного, эмульсионного слоя в среде вода-этилацетат и водного. При этом происходит перераспределение веществ водного извлечения, способных растворяться в этилацетате, в том числе липидов и фенолов.

Для идентификации и сравнения нейтральных и полярных липидов, извлекаемых этилацетатом из водных извлечений чаги, полученных из различного сырья, был проведен анализ этилацетатных и эмульсионных слоев с помощью одного из наиболее эффективных и универсальных методов разделения смесей липидов и их липофильных фрагментов – методом тонкослойной хроматографии (ТСХ).
Результаты ТСХ, перешедших в этилацетатные слои нейтральных липидов, постадийно извлекаемых из исследуемых водных извлечений чаги, приведены на рисунке 1. Нейтральные липиды этилацетатных слоев, полученных из разного сырья чаги, близки по составу. В них идентифицированы моно-, ди- и триацилглицериды, стерины, жирные кислоты, о-алкилдиглицериды. На хроматограммах проявляется пятно с Rf = 0,88–0,89, что может свидетельствовать о присутствии в объектах исследования углеводородов, триалкиловых эфиров глицерина, эфиров стеринов или восков. Они отличаются тем, что в этилацетатном слое, полученном при обработке этилацетатом водного извлечения чаги второго образца сырья, содержатся о-диалкилдиглицериды.

Хроматограммы полярных липидов, перешедших в этилацетатные слои, постадийно извлекаемых из водных извлечений чаги, приведены на рисунке 2. Полярные липиды этилацетатных слоев, полученных из разного сырья чаги, значительно различаются по составу. Этилацетатный слой, полученный из первого образца сырья, содержит более разнообразный состав полярных липидов. Были идентифицированы фосфатидилэтаноламин, лецитин, сфингомиелин, фосфатидилинозит и лизолецитин. Пятна с Rf = 0,03 на хроматограмме могут быть отнесены к фосфатидилсерину, лизофосфатидной или фосфатидной кислотам, имеющим близкие значения Rf. В этилацетатном слое из второго образца сырья показано присутствие только фосфатидилэтаноламина или дигалактозилдиглицерида, которые имеют близкие значения Rf.

Для определения жирных кислот, перешедших в этилацетатный слой из второго образца сырья, последний после концентрирования был обработан гексаном, который затем проанализирован с применением ГЖХ. Идентифицированы лауриновая (С12:0), миристиновая (С14:0), пентадекановая (С15:0), пальмитиновая (С16:0), стеариновая (С18:0), олеиновая (С18:1) и линолевая (С18: 2) кислоты.

Для исследования липидов, перешедших в эмульсионный слой при обработке водного извлечения чаги этилацетатом, их отделяли из эмульсионного слоя растворением в смеси хлороформ : спирт (1 : 2) [8]. Как показано на рисунке 3 (нулевая точка на старте хроматограмм), свободных липидов не было обнаружено. В коллоидных растворах эмульсионного и водного слоев формируются дисперсные фазы этих слоев (ПФК1 и ПФК2 соответственно) [7].

Для определения липидов, находящихся в связанном состоянии, был проведен щелочной гидролиз исследуемых эмульсионных слоев метанольным 1% раствором гидроокиси калия в течение 14 и 18 ч. Каждая проба анализировалась на наличие нейтральных и полярных липидов.
Высвобождение связанных нейтральных липидов происходит ко второму часу гидролиза эмульсионных слоев, что показано на рисунке 3. Состав связанных нейтральных липидов эмульсионных слоев аналогичен соответствующему составу липидов этилацетатных слоев. Далее, по времени проведения гидролиза в гидролизатах начинают накапливаться продукты омыления моно-, ди- и триацилглицеридов. В гидролизате эмульсионного слоя (первый образец сырья) омыление триацилглицеридов заканчивается к 12 ч, а в гидролизате эмульсионного слоя (второй образец сырья) – только к 16 ч. После шестнадцати часов проведения гидролиза на хроматограмме гидролизата эмульсионного слоя (из второго образца сырья) наблюдаются продукты реакции этерификации жирных кислот.

Для получения чистых метиловых эфиров жирных кислот, с целью установления состава жирных кислот с помощью ГЖХ была подобрана более высокая концентрация гидролизующего агента. Как показано на рисунке 4, применение метанольного 10% раствора гидроокиси калия позволяет получить эти соединения уже через четыре часа от начала проведения гидролиза эмульсионного слоя.

Анализ жирных кислот, входящих в состав связанных липидов эмульсионных слоев, проведенный с помощью ГЖХ, позволил обнаружить сходство и различие состава жирных кислот исследуемых объектов. В эмульсионных слоях (два вида сырья) идентифицированы миристиновая (С14:0), пальмитиновая (С16:0), олеиновая (С18:1) и линолевая (С18:2) кислоты, кроме этих кислот в эмульсионном слое (первое сырье) обнаружены каприловая (С8:0), каприновая (С10:0), лауриновая (С12:0), линоленовая (С18: 3) и эйкозеновая (С20:1), а в эмульсионном слое (второе сырье) – тридекановая (С13:0), пентадекановая (С15:0), гептадекановая (С17:0) и стеариновая (С18:0) кислоты.

Для анализа полярных липидов, находящихся в связанном состоянии в эмульсионном слое, проведена обработка гидролизатов этого слоя (из второго сырья) последовательно петролейным эфиром, затем смесью хлороформ:спирт (1 : 2). На хроматограмме гидролизата только после двухчасового гидролиза обнаружено пятно с Rf = 0,03, которое может быть отнесено к фосфатидилсерину, лизофосфатидной или фосфатидной кислотам, имеющим близкие значения Rf. Вероятно, в условиях щелочного гидролиза происходит разрушение полярных липидов либо их количество незначительно.
Как показало проведенное исследование, липиды имеют большое значение в формировании коллоидной системы водного извлечения чаги. При обработке водного извлечения чаги этилацетатом они обнаружены как в этилацетатном, так и в эмульсионном слоях. Вероятно, при экстракции чаги водой липиды, переходя в коллоидную систему водного извлечения, ассоциируются с ПФК, образуя в нем гидрофобные участки. Выявленное отличие составов полярных липидов и жирных кислот, полученных из двух видов сырья, может быть связано с различно протекающим метаболизмом гриба, зависящим от условий его роста. Среди найденных в водных извлечениях чаги липидов к биологически активным относятся стерины, ненасыщенные и полиненасыщенные жирные кислоты, полярные липиды.

Выводы:
1. Определен состав нейтральных, полярных липидов и жирных кислот, входящих в состав коллоидной системы водных извлечений чаги, полученных из различных образцов сырья.
2. Установлено отличие нейтральных, полярных липидов и жирных кислот при получении водных извлечений из различного сырья чаги.
3. Показано отличие состава полярных липидов и жирных кислот в этилацетатном и эмульсионных слоях, образуемых при экстракции водного извлечения чаги этилацетатом.

Список литературы:
1. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. О химическом составе чаги // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л., 1959. С. 55–62.
2. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В. Характеристика древоразрушающих грибов по содержанию в них стероидных соединений // Кормовые белки и физиологически активные вещества для животноводства. М., Л., 1965. С. 59–64.
3. Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С., Суханов П.П. Структурная организация и свойства полифенолов чаги //Вестник Казанского технологического университета (КГТУ). 2005. №1. С. 244–250.
4. Рыжова Г.Л., Кравцова С.С., Матасова С.А., Грибель Н.В., Пашинский В.Г., Дычко К.А. Химические и фармакологические свойства сухого экстракта чаги // Химико-фармацевтический журнал. 1997. №10. С. 44–47.
5. Шиврина А.Н. Химическая характеристика действующих начал чаги // Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. М., Л., 1966. С. 49–55.
6. Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С., Халитов Ф.Г., Суханов П.П. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами // Вестник Казанского технологического университета (КГТУ). 2003. №2. С. 172–179.
7. Юмаева Л.Р., Хабибрахманова В.Р., Сысоева М.А., Гамаюрова В.С. Извлечение липидов из водной вытяжки чаги // Пищевые технологии: мат. Общероссийской конф. молодых ученых с межд. участием. Казань, 2006.С. 118–119.
8. Кейтс М. Техника липидологии. М., 1975. 324 с.