ИССЛЕДОВАНИЕ ЗОЛЯ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ. XII. ОСАЖДЕНИЕ ДИСПЕРСНОЙ ФАЗЫ ВОДНОГО ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЧАГИ ПРИ ИЗМЕНЕНИИ рН СРЕДЫ М.А. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова1, В.С. Гамаюрова, Н.К. Шаехова, Ф.Г. Халитов Казанский государственный технологический университет, ул. К. Маркса,68, Казань, Республика Татарстан (Россия) Казанский государственный энергетический университет, ул. Красносельская, 51, Казань, Республика Татарстан (Россия)

Проведено последовательное осаждение дисперсной фазы водного извлечения чаги изменением рН среды. Получены полифенол-оксикарбоновые комплексы (ПФК). Определено количество фенольных соединений, углеводов, белка, переходящих в состав этих ПФК при их осаждении. Приведены электронные и ИК-спектры ПФК, определена антиоксидантная активность.

Введение
Водные извлечения чаги применяются для профилактики и лечения предраковых заболеваний и рака различной этиологии [1].
Основную часть веществ, экстрагируемых водой из чаги, составляет полифенолоксикарбоновый комплекс (ПФК), образующий в водных извлечениях коллоидную гидрофильную полидисперсную систему.
Дисперсионная среда этой системы содержит соли органических и минеральных кислот, полисахариды, полифенолы [2] и другие, еще не выявленные, компоненты [3].
Агрегативная устойчивость лиофильных коллоидных систем не остаётся постоянной. Процесс седиментации коллоидных частиц можно ускорить добавлением электролитов из числа нейтральных солей или минеральных кислот, резко изменяющих рН среды. Было установлено, что коллоидная система водного извлечения чаги достаточно устойчива при добавлении к ней нейтральных солей одновалентных катионов, таких как хлористый натрий. Эффективно осаждают ПФК другие электролиты при использовании их в низкой концентрации, например, хлористый кальций в концентрации 16%, алюминиевые квасцы в концентрации 8% и уксуснокислые соли свинца, меди и цинка в концентрации 2% [4].
Минеральные кислоты (хлористоводородная, серная и фосфорная) осаждают ПФК при значениях рН 2–2,5 [4]. Практическое применение имеет осаждение ПФК хлористоводородной кислотой. Применение этого осаждающего агента используют для оценки содержания ПФК в получаемых водных извлечениях. Именно с его количественным содержанием в водном извлечений чаги связывают терапевтическую эффективность фармакологических препаратов, получаемых на основе извлечений [5]. Хлористоводородной кислотой осаждается 9–15%
ПФК от взятого на экстракцию сырья или 50–70% от сухого остатка водного извлечения чаги [6, 7].
Смещение рН в щелочную область добавлением щелочных растворов не приводит коллоидную систему водного извлечения в неустойчивое состояние. Интенсивность окраски усиливается, седиментации дисперсной фазы не происходит. Выделенный осаждением хлористоводородной кислотой ПФК не растворяется в воде, но растворяется в щелочных растворах [6].
Целью исследования являлось сравнить агрегативную устойчивость водного извлечения чаги в отношении хлористоводородной кислоты и спиртового раствора щелочи. Показать сходство и отличие формируемых при этом ПФК.

Экспериментальная часть
Для экстракции использовали сырье чаги, приобретенное в аптечной сети. Вытяжки получали согласно методике [8]. Осаждение ПФК осуществляли добавлением хлористоводородной кислоты [9] или 1% ратвором гидроокиси калия в этаноле. Образовавшиеся осадки отделяли фильтрованием и высушивали при
комнатной температуре в тонком слое. Электронные спектры 0,001% растворов ПФК в 0,1 н растворе гидроокиси натрия снимали на спектрофотометре UNICO UV/VIS 2800 [10].
ИК-спектры выделенных ПФК снимают в таблетках KBr на спектрофотометре UR-20. Антиоксидантную активность ПФК определяли с помощью кулонометрического метода, основанного на взаимодействии водных экстрактов и растворов с электрогенерированными соединениями брома [11, 12]. Электрогенерацию брома осуществляли на потенциометре П-5827М при постоянной силе тока 5,0 мА из 0,2 М KBr
в H2SO4. Конец титрования определяли амперометрически, в ячейке с двумя поляризованными платиновыми электродами (∆Е = 300 мВ).
Сухой остаток и зольность определяли по стандартным методикам [5, 11]. Количественное определение углеводов, фенолов, белков осуществляли согласно [5, 13].

Обсуждение результатов
Седиментация дисперсной фазы водного извлечения чаги при добавлении хлористоводородной кислоты позволяет получить 13,58% ПФК от сухого остатка водного извлечения чаги. При этом после его отделения фильтрат имеет коричнево-желтую окраску. Добавление к нему (в отдельности) хлористоводородной кислоты, этанола или водного раствора гидроокиси калия не приводит к дополнительному осаждению ПФК. Применение спиртового раствора щелочи позволяет осадить дополнительно 4,79%
ПФК. Обозначим первый ПФК, осажденный кислотой, как ПФКК1, а второй, осаждённый щелочью, ПФКщ2. Соответственно, фильтрат, полученный после первого осаждения, – фильтрат К1, а после второго осаждения – фильтрат Щ2.
Проведено осаждение водного извлечения сначала спиртовым раствором щелочи. Получен ПФКщ1, в количестве 17,24% от сухого остатка водного извлечения чаги. Осаждение полученного фильтрата (фильтрат Щ1) проводили хлористоводородной кислотой и получили ПФКк2, в количестве 2,01%, а также фильтрат К2.
Суммарно при последовательном осаждении водного извлечения чаги сначала кислотой, а затем щелочью, и наоборот, получено почти равное количество ПФК. Причем осаждение водного извлечения чаги спиртовым раствором щелочи позволяет получить на 26,95% ПФК больше, чем осаждением хлористоводородной кислотой.
Для определения включения фенолов, углеводов, белка в состав ПФК при применении осаждающих агентов было определено их количество в фильтратах. Полученные результаты приведены в таблице.
При осаждении водного извлечения кислотой в состав ПФКк1 переходит 79,14% фенольных соединений, 58,52% углеводов и 89,40% белка, находившихся в водном извлечении в свободном состоянии.
Осаждение водного извлечения спиртовым раствором щелочи приводит к более полному переходу свободных фенольных соединений (93,48%) и углеводов (83,41%) в состав ПФК. При этом количество белка в фильтрате остается на уровне его содержания в свободном состоянии в водном извлечении чаги или
незначительно превышает это значение. Следовательно, в этом случае белок стабилизируется в фильтрате и не ассимилируется с осаждаемым ПФКщ1. Зольность ПФКщ1 (0,0325 г/0,1гПФКщ1) возрастает по сравнению с зольностью ПФКк1 (0,0047 г/0,1г ПФКк1) в семь раз.

Содержание фенолов, углеводов и белка в водном извлечении чаги и фильтратах, полученных с помощью различных осаждающих агентов
Объект исследования Фенолы, %* Углеводы, %* Белок, %*
Водное извлечение чаги 2,30 13,38 1,32
Фильтрат К1 0,48 5,55 0,14
Фильтрат Щ2 0,05 0,60 5,29
Фильтрат Щ1 0,15 2,22 1,87
Фильтрат К2 0,29 0,93 – * от сухих веществ объекта исследования

После осаждения водного извлечения хлористоводородной кислотой получается фильтрат с низким значением рН (2–2,5). Добавление спиртового раствора щелочи создает такие условия дисперсионной среды, что происходит высаливание белка. Массовая доля сырого протеина в водном извлечении чаги составляет 2,77% от сухого остатка водного извлечения чаги. Содержание белка в фильтрате Щ2 в пересчете на сухой остаток водного извлечения чаги составляет 2,78%. Практически весь белок, содержащийся в водном извлечении чаги, полностью остается в фильтрате, не входя в состав выпадающего в
осадок ПФКщ2. В его состав переходит 89,58% оставшихся фенольных соединений и 89,18% углеводов.
После осаждения водного извлечения спиртовым раствором щелочи фильтрат имеет щелочную реакцию среды (рН≈8–9). Добавление кислоты к этому фильтрату приводит в полному включению оставшегося белка в состав ПФКк2. В его состав также переходит 58,11% оставшихся углеводов. Фенольные соединения при осаждении частиц дисперсной фазы этой коллоидной системы, наоборот, переходят из
ПФКк2 в фильтрат К2, и количество этих соединений возрастает в нем почти в два раза по сравнению с их количеством в фильтрате Щ1, из которого осаждают ПФКк2.
Следовательно, ПФК, полученные при использовании различных осаждающих агентов, могут отличаться по другим физико-химическим характеристикам.

Спектры для всех объектов исследования представляют собой кривые пологие линии, для которых по мере возрастания длинны волны наблюдается постепенное уменьшение оптических плотностей.
Спектры ПФКк1 и ПФКщ1 практически идентичны. Резко отличаются от них спектры ПФК, которые были выделены из фильтратов, полученных после их осаждения из водного извлечения чаги. Спектр ПФКщ2, в состав которого, в отличие от остальных ПФК, не входит белок, имеет самые низкие значения оптической плотности
из всех исследованных ПФК. Спектр ПФКк2, в отличие от других ПФК, имеет максимум поглощения при 270–280 нм. Это подтверждает то, что при осаждении в его состав переходит весь белок, содержавшийся в фильтрате. Кроме того, отнесение этого поглощения к белку в ПФКк2, может подтвердить потеря части фенольных соединений комплексом при его осаждении, имеющих поглощение в этой же области спектра.

Ранее было показано, что при использовании различных способов получения водных извлечений чаги, применении в экстракции комплексонов, наибольшие изменения в спектре ПФКк1 на молекулярном уровне происходят в области колебаний связей карбоксильных групп и карбоксилат иона 1200–1800 см–1 [11].
Отличие ПФКк1 от ПФКщ1 заключается в том, что во втором случае наблюдается увеличение в его составе фенольных соединений, углеводов и меньшее количество белка. В области 1200–1800 см–1 проявляются колебания других присутствующих в ПФК связей, таких как колебания СН бензольных колец, СН и СН2 колебания алкильных радикалов, С=С и С=О-связей, а также колебания эфирных связей. Интенсивность полос поглощения, относящихся к этим колебаниям, может увеличиться во втором спектре.
Основным отличием этих комплексов является то, что ПФКщ1 содержит в семь раз больше зольных элементов по сравнению с ПФКк1. Действительно, на спектрах 1 и 2 наблюдаются 4 сильных полосы поглощения с ν(С-О) 1240 см–1 и ν(С=О) 1720 см–1, отнесенные к колебаниям карбоксильной группы, а также νS
1400 и 1620 см–1 , отнесенные к карбоксилат иону [8]. Во втором спектре относительные интенсивности полос при 1400 и 1620 см–1 увеличиваются по сравнению с интенсивностью полос 1240 и 1720 см–1, в первом спектре. Это свидетельствует о наличии в ПФКщ1 большего количества карбоксилат ионов, по сравнению с присутствием в ПФКк1 большего количества свободных карбоксильных групп. Кроме этого, можно предположить, что столь сильные изменения, происходящие в ИК-спектрах, свидетельствуют о различной структурной организации ПФКк1 и ПФКщ1.


Определена антиоксидантная активность полученных ПФК. Осаждение водного извлечения чаги хлористоводородной кислотой позволяет получить ПФКк1 с антиоксидантной активностью (27,5 кКл/100 г) в
1,6 раза выше, чем ПФКщ1 (17,0 кКл/100 г) при использовании для осаждения спиртового раствора щелочи.
Антиоксидантная активность ПФКщ2 составляет 108,0 кКл/100 г, что в четыре раза выше, чем у ПФКк1.
Антиоксидантная активность ПФКк2 составляет всего 6,8 кКл/100 г. Возможно, столь большое различие этих значений у ПФКщ2 и ПФКк2 объясняется тем, что исключение белка при формировании ПФКщ2 делает более доступными участки комплекса, отвечающие за его антиоксидантные свойства. Большую роль
может играть потеря части фенольных соединений ПФКк2, которые переходят в фильтрат при его осаждении. Кроме того, необходимо отметить, что после осаждения ПФКк1 в фильтрате формируется новая коллоидная система, дисперсная фаза которой обладает высокой антиоксидантной активностью.
Физико-химические характеристики, в том числе антиоксидантная активность, полученных ПФК свидетельствуют о различной структурной организации комплексов. Это хорошо коррелирует с включением в состав ПФК фенольных соединений, углеводов и белка при различных способах осаждения комплексов.

Выводы
1 Установлено, что осаждение дисперсной фазы водного извлечения чаги можно проводить как хлористоводородной кислотой, так и спиртовым раствором щелочи. При этом полученные ПФК отличаются по компонентам, входящим в их состав, по ИК- спектрам и антиоксидантной активности.
2 Показано, что после удаления ПФК из водного извлечения чаги при изменении его рН среды в фильтрате формируется новая коллоидная система, дисперсную фазу которой можно выделить, также изменив рН среды.
3 Определено, что ПФК, полученные последовательным осаждением дисперсной фазы водного извлечения чаги, имеют более существенные отличия по составу компонентов, ассимилируемых ими при осаждении. Это отражается в изменении их электронных спектров и антиоксидантной активности.

Список литературы
1. Рыжова Г.Л., Кравцова С.С., Матасова С.А., Грибель Н.В. и др. Химические и фармакологические свойства сухого экстракта чаги // Химико-фармацевтический журнал. 1997. №10. С. 44–47.
2. Калашникова Е.А. Изучение химического состава и стандартизация сырья чаги и лекарственного препарата: автореф. дис. … канд. фарм. наук. Пятигорск, 2003. 23 с.
3. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. К характеристике комплекса сложных органических соединений чаги // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л., 1959. С. 72–84.
4. Якимов П.А. Андреева С.М., Алексеева Е.В. О причинах изменения устойчивости пигментного комплекса в водных экстрактах чаги // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. М.Л., 1961. С. 113–119.
5. Государственная фармакопея: 11-е изд., доп. Вып. 2. М., 1987. 336 с.
6. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. О химическом составе чаги // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л., 1959. С. 55–61. ИССЛЕДОВАНИЕ ЗОЛЯ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ … 135
7. Кузнецова О.Ю. Физико-химические характеристики и биологическая активность водных извлечений и полифенолоксикарбонового комплекса чаги: автореф. дис. … канд. хим. наук. Казань, 2004. 20 с.
8. Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С., Халитов Ф.Г., Суханов П.П. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами //Вестник Казанского технологического университета (КГТУ). 2003. №2. С. 172–179.
9. Муравьева Д.А. Фармакогнозия. М., 1981. С. 625–627.
10. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв. М., 1974. 287 с.
11. Кузнецова О. Ю., Гамаюрова В.С., Суханов П.П., Зиятдинова Г.К., Будников Г.К. Исследование золя вводных извлечений чаги. IV. Антиоксидантная активность. Влияние способа извлечения и применение комплексонов, гидроокиси натрия // Химия растительного сырья. 2005. №1. С. 41–47.
12. Абдуллин И.Ф., Турова Е.Н., Будников Г.К. Электрогенерированный бром – реагент для определения антиоксидантной способности соков и экстрактов // Заводская лаборатория. 2002. Т. 68. №9. С. 12–15.
13. Полюдек-Фабини Р., Бейрих Т. Органический анализ. Л., 1981. 623 с.