ВЛИЯНИЕ ПАРАМЕТРОВ ДИСПЕРГИРОВАНИЯ КРАПИВЫ ДВУДОМНОЙ (URTICA DIOICA L) НА ИЗМЕНЕНИЯ СТЕПЕНИ ИЗМЕЛЬЧЕНИЯ, ВЫХОДОВ И СВОЙСТВ ЭКСТРАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Н.В. Юдина, А. А. Иванов , Ю.В. Лоскутова, СИ Писарева, В.Н. Буркова Институт химии нефти СО РАН, пр. Академический, 4, Томск (Россия)

Диспергирование листьев крапивы двудомной значительно увеличивает выход водноспиртовых и жирорастворимых экстрактивных веществ и биологически активных соединений. Показано влияние времени диспергирования, воздушной и инертной среды на содержание в экстрактах крапивы полифенолов, каротиноидов, хлорофиллов и антиоксидантов. Механообработка листьев крапивы в инертной среде снижает агломерацию частиц диспергированных порошков во времени, что обеспечивает сохранность состава и свойств экстрактов.

Введение
Растения рода крапива содержат огромный набор биологически активных веществ и занимают особое место среди лекарственных растений, используемых в народной и официальной медицине [1-3]. Химический состав крапивы представлен белковоуглеводно-витаминным комплексом. Ее фармакологические свойства во многом определяются наличием в ней /?-каротина и каротиноидов. Однако биополимерные молекулы, связанные в агрегаты и структуры переплетения, в недостаточной степени извлекаются обычной экстракцией растворителями. Проблема перевода имеющихся в природном сырье веществ в биологически активную форму решается в последнее время с применением прогрессивных нанотехнологий [4-6]. Нанотехнологий позволяют обогащать извлечения из растительного лекарственного сырья биологически активными веществами за счет перевода в биологически доступную форму минорных компонентов межклеточного матрикса растительных клеток [7].
В настоящей работе представлены сравнительные данные о составе и свойствах экстрактивных веществ, полученных из высушенных листьев крапивы двудомной, подвергнутых диспергированию в мельнице-активаторе.

Экспериментальная часть
Объектом исследования является крапина двудомная (Urtica dioica L), собранная в Алтайском крае (с. Алтайское).
Диспергирование крапивы двудомной осуществляли в роликовой мельнице РМ-50, в которой предполагается два основных режима обработки исходных материалов - ударное и истирающее воздействие с преобладанием последнего режима [8, 9]. Основными рабочими элементами являются металлические ролики, укрепленные на вращающемся роторе и расположенные по всей высоте корпуса.
Степень диспергирования сырья, выход и состав продуктов исследовались в зависимости от следующих режимов обработки: 1 - без обработки; 2 - время обработки 6 сек, температура продукта на выходе - 30 °С, воздушная среда; 3 - 12 сек, 30 °С, воздушная среда; 4 - 18 сек, 30 °С, воздушная среда; 5 -24 сек, 30 °С, воздушная среда; 6 - 30 сек, 30 °С, вакуумная сушка сырья; 7 - 18 сек, 30 °С, в среде азота; 8 - 18 сек, 40 °С, воздушная среда.

Размер частиц диспергированной крапивы оценивали методом мягкой неразрушающей абляции и электронной микроскопии.
Для измерения размера наночастиц с помощью мягкой неразрушающей абляции под действием терагерцового излучения лазера на свободных электронах и диффузионного спектрометра аэрозолей использовали метод, разработанный ранее группой сотрудников институтов СО РАН (Института цитологии и генетики, Института ядерной физики и Института химической кинетики и горения СО РАН) [10]. Абляция представляет собой перевод молекул в аэрозольную фазу из твердой или жидкой фазы без изменения формы. До недавнего времени абляция не могла быть использована для дисперсного анализа, так как исследуемое вещество разрушалось в процессе перехода в газовую фазу. Однако после обнаружения явления мягкой неразрушающей абляции такой анализ стал возможен. Диффузионный спектрометр аэрозолей (ДСА), разработанный в Институте химической кинетики и горения СО РАН, предназначен для автоматического определения концентрации и спектра размеров аэрозольных частиц. Принцип действия прибора основан на известной зависимости коэффициента диффузии микрочастиц от их размера. Прибор работает под управлением ЭВМ типа IBM PC.
Для электронной микроскопии применялся просвечивающий электронный микроскоп LIBRA 120 (фирмы ZEISS).
Для определения выхода экстрактивных веществ листья крапивы измельчали и проводили экстракцию 40% этиловым спиртом и хлороформом при перемешивании 1000 об./мин в течение 1 ч [11-13]. После центрифугирования растворители отгоняли на роторном испарителе, а экстракты сушили до постоянного веса и взвешивали. В водноспиртовых экстрактах определяли содержание полифенолов, а из хлороформных экстрактов методом тонкослойной хроматографии выделены каротиноиды и хлорофиллы на силикагеле марки LSL X 254 5/40 мкм. Для разделения каротиноидов использовали систему растворителей гексанхлороформ в соотношении 1 : 1. Идентификацию основных пигментов осуществляли спектральными методами. Спектры поглощения индивидуальных каротиноидов получены в видимой области на спектрофотометре в гексане, бензоле, хлороформе, этаноле и ацетоне [14]. Хлорофиллы и каротиноиды были идентифицированы методом УФ-спектроскопии по длинам волн максимумов поглощения и индексам удерживания при тонкослойном разделении и по соотношению оптических плотностей при характеристических длинах волн - 660 нм для хлорофиллов и 450 нм для каротиноидов.

Содержание антиоксидантов (АО) в хлороформных экстрактах из диспергированной крапивы определяли кинетическим методом при помощи модельной реакции инициированного окисления кумола при 60 °С в присутствии инициатора [15]. По кинетической кривой рассчитывали период индукции и концентрацию АО, константы скорости окисления определяли по полулогарифмической анаморфозе кинетической кривой поглощения кислорода кумолом.
Биологическую активность экстрактов из диспергированной крапивы оценивали на модели гастротоксического (ацетилсалициловая кислота) язвообразования на 60 белых мышах массой 20-24 г в НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН. В качестве эталона сравнения использовали облепиховое масло. В слизистой оболочке желудков животного рассчитывали количество язв, вычисляли индекс Паулса [16].

Результаты и обсуждение
Биологически активные вещества представлены в крапиве двудомной во до- и жирорастворимыми веществами. Вследствие этого экстракцию проводили 40% спиртом и хлороформом. На рисунке 1 представлены экспериментальные данные по влиянию условий диспергирования листьев крапивы на выход веществ, экстрагируемых 40% спиртом. Независимо от условий обработки количество экстрактивных веществ возрастает в 2 раза. Изменение продолжительности диспергирования листьев крапивы от 6 до 24 сек повышает количество извлекаемых веществ на 14%, а полифенолов - на 25%. Это связано в первую очередь с уменьшением размера частиц при диспергировании листьев крапивы и разрывом различных связей, в том числе гликозидных. Об этом свидетельствуют результаты определения размеров частиц крапивы методами мягкой неразрушающей абляции с помощью терагерцового излучения и электронной микроскопии (рис. 2). После обработки листьев крапивы в роликовой мельнице в течение 24 сек обнаружены частицы размером 25-79 нм.
Увеличение температуры обработки сырья и замена воздушной среды на инертную также приводит к повышению количества экстрактивных веществ, что объясняется образованием большего числа наноразмерных частиц в диспергированных продуктах и предотвращением их окисления кислородом воздуха (рис. 1).

Влияние условий диспергирования листьев Рис. 2. Спектр аэрозольных частиц, выявленных в крапивы на выход веществ, экстрагируемых 40% диспергированных образцах крапивы после 24 сек раствором спирта обработки
Зависимость количества извлекаемых липидных компонентов (хлороформом) от режима диспергирования листьев крапивы имеет аналогичный характер, как и для водноспиртовых фракций (рис. 3). Следует отметить, что липиды выделяются из сырья, измельченного до размера частиц 1 мм, в очень незначительном количестве. Диспергирование листьев крапивы до наноразмерных частиц повышает их выход в 30-100 раз.
В полученных нами экстрактах анализировалось содержание каротиноидов в пересчете на /?-каротин и хлорофиллов в пересчете на хлорофилл а. В экстракте листьев крапивы, измельченных до размера 1 мм, содержание этих веществ составляло соответственно 78±6 мг% (рис. 4) и 0,0128±0,002 мкмоль/г (рис. 5). При диспергировании сырья до размера частиц менее 100 нм количество каротиноидов и хлорофиллов возрастает в 2-2,5 раза. Четкой закономерности в изменении содержания каротиноидов и хлорофиллов в экстрактах от времени диспергирования листьев крапивы не прослеживается (рис. 4 и 5). Наибольшее количество каротиноидов и хлорофиллов выделяется из крапивы, диспергированной в течение 6 сек.
Одним из важных показателей биологической активности природных БАВ является содержание АО и их реакционная способность. К АО, обрывающим цепи окисления за счет взаимодействия с пероксидными радикалами, относятся соединения с функциональной группой, содержащей подвижный атом водорода -OH; -NH; -SH. В процессе естественного ингибирования природных систем участвуют соединения, содержащие фенольные и аминные группы. Однако образование внутримолекулярных и межмолекулярных водородных связей между ними не позволяют реакционным центрам в полной мере участвовать в процессах ингибирования окисления.

Влияние условий нанодиспергирования. Влияние условий нанодиспергирования
листьев крапивы на выход липидных компонентов, в роликовой мельнице на содержание
экстрагируемых хлороформом каротиноидов в экстрактах крапивы двудомной

Результаты определения АО представлены. В экстракте из исходного сырья выявлено два типа АО, и содержание их составляет 0,13 моль/кг, в пересчете на ионол - 2,0% мае. По величинам констант скорости окисления можно судить о невысокой их реакционной способности. Диспергирование крапивы двудомной в роликовой мельнице при разных условиях приводит к изменению количества АО в липидах. В выделенных экстрактах присутствует один тип АО, характеризуемый также невысокой реакционной способностью. Максимальным количеством АО отличается образец, полученный при диспергировании крапивы в течение 6 сек (3,4% мае. на ионол). Однако более высокой реакционной способностью отличаются АО липидов крапивы, обработанной в течение 24 сек.

Рис. 5. Влияние условий нанодиспергирования в роликовой мельнице на содержание хлорофиллов в экстрактах крапивы двудомной
Увеличение количества АО может быть связано как с разрывом водородных связей и высвобождением –ОН и -NH –групп, способных проявлять антиоксидантные свойства, так с увеличением гидроксильных групп в поверхностной структуре диспергированной крапивы в присутствии воздуха и воды (в сырье 8-10% влаги). О повышении гидроксильных групп в составе молекул липидов свидетельствовали данные ИК-спектроскопии - возросла интенсивность полос поглощения, отвечающих за –ОН группы (3400 см–1).
Поскольку высокая удельная поверхность и поверхностная энергия наночастиц способствуют их агломерации [17], проведены исследования по влиянию времени хранения диспергированных порошков крапивы на содержание в них хлороформных экстрактов и каротиноидов. В таблице 2 приведены результаты, свидетельствующие об уменьшении выхода экстрактивных веществ и каротиноидов через месяц после диспергирования крапивы двудомной. Диспергирование приводит к образованию новой поверхностной структуры с гидроксилами, поскольку химическая адсорбция и химические реакции имеют место благодаря окружающим веществам, таким как воздух и вода.
Притяжение между наночастицами благодаря взаимодействию между гидроксилами является основной причиной агломерирования нанопорошков в атмосфере воздуха. Это может быть одной из причин снижения выхода экстрактивных веществ из диспергированного сырья после длительного хранения.
Известно, что регулирование поверхностной структуры чистых нанопорошков не вызывает агломерации [17]. Вакуум, обработка в инертном газе и поверхностное модифицирование являются эффективными средствами для получения неагломерированных нанопорошков. Анализ образцов, диспергированных в инертной атмосфере и после вакуумной сушки, свидетельствует о незначительном снижении выхода экстрактивных веществ и содержания каротиноидов.
Широкий набор биологически активных веществ, содержащихся в крапиве, объясняет ее различные фармакологические свойства. Наибольшую биологическую активность проявляет /?-каротин. С ним связывают противоязвенное действие препаратов природного происхождения. При моделях язвенной патологии желудка препарат крапивы, экстрагированный из листьев с размером частиц менее 100 нм, оказывал гастропротективный эффект не слабее действия эталонного противоязвенного средства - облепихового масла (табл. 3).

Содержание и реакционная активность антиоксидантов в липидных экстрактах, выделенных из образцов крапивы, диспергированных в роликовой мельнице

Режимы диспергирования Собщ, моль/кг С, моль/кг С, моль/кг 1k7 10 , л/моль сек 2k710 , л/моль сек Cобщ, % мас.(в пересчете на ионол)
Без обработки 0,13 0,06 0,12 1,4 5,3 2,0
Температура 30 °С, время обработки, сек
6 12 18 24 0,31 0,15 0,23 0,23
– – – – 0,31 0,15 0,23 0,23
– – – – 3,1 2,8 2,7 10,0 3,4 1,7 2,5 2,5

Влияние условий диспергирования и времени хранения порошков крапивы двудомной на выход экстрактивных веществ и содержание каротиноидов
Содержание экстрактивных веществ
Условия обработки липиды, % мае. каротиноиды, мг %
сразу через 1 мес. сразу через 1 мес.
Без обработки 0,13 0,13 78 78
Роликовая, 6 сек, 30 °С 4,3 3,5 145 121
12 сек, 30 °С 5,1 4,1 130 123
18 сек, 30 °С 10,8 6,2 153 135
24 сек, 30 °С 12,0 6,5 120 111
30 сек, 30 °С, вакуум 13,3 10,4 158 145
18 сек, 30 °С, азот 19,0 17,0 124 121
Таблица 3. Влияние экстракта листьев крапивы и облепихового масла на развитие экспериментальных язв желудка

Экспериментальная группа Среднее количество язв Индекс Паулса
Ацетилсалициловая кислота 44,9+2,3 44,9
Экстракт крапивы, 250 мг/кг, менее 100 нм 13,2+1,7 11,9
Экстракт крапивы, 250 мг/кг, 1 мм 24,0+1,7 7,9
Облепиховое масло, 250 мг/кг 14,1+2,2 8,5

Заключение
Таким образом, в результате проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Диспергирование листьев крапивы двудомной увеличивает выход водноспиртовых и жирорастворимых биологически активных соединений. Повышение времени обработки приводит к уменьшению размера частиц и значительному увеличению количества извлекаемых веществ. Инертная среда при этом способствует меньшему окислению каротиноидов и хлорофиллов.
2. Диспергирование листьев крапивы двудомной приводит к повышению количества антиоксидантов в липидных экстрактах.
3. Количество извлекаемых экстрактивных БАВ снижается через месяц после диспергирования сырья.
4. При моделях гастротоксического язвообразования экстракт крапивы, полученный из листьев, диспергированных до наночастиц, в большей степени защищает слизистую оболочку желудка, чем экстракт этого растения, приготовленный из листьев, измельченных до размера 1 мм.

Список литературы
1. Крылов Г.В. Травы жизни и их искатели. Томск, 1992. C. 163-165.
2. Павлов М. Энциклопедия лекарственных растений. М., 1998. C. 160-162.
3. Универсальная энциклопедия лекарственных растений / сост. И. Путырский, В. Прохоров. М., 2000. C. 160-165.
4. Ломовский О.П., Белых В. Д. Механохимическая экстракция водорастворимых компонентов из растительного липидсодержащего сырья // Обработка дисперсных материалов и сред. Одесса, 2000. №10. С. 71-75.
5. Иванов А.А., Ломовский О.И., Рожанская О.А. и др. Изменение состава и свойств водорастворимых компонентов торфа при механохимической обработке // Химия в интересах устойчивого развития. 2004. №3. С. 355-361.
6. Chuev V.P., Kameneva O.D., Chikalo T.M. Use of mechanochemical activation to modify properties of bioactive compounds // Сибирский химический журнал. 1991. Вып. 5. С. 156-157.
7. Ломовский О.И., Болдырев В.В. Механохимия в решении экологических задач. Новосибирск, 2006. 221 с.
8. Lomovsky O.I., Denisov M.G., Avvakumov E.G. Mechanochemical equipment of the Institute of Solid State Chemistry // INCOME-2. 2-nd Intern. Conf. On Mechanochemistry and Mechanical Activation. Abstracts. Novosibirsk, 1997. Pp. 140-141.
9. Аввакумов Е.Г. Механические методы активации химических процессов. Новосибирск, 1986. 305 с.
10. Петров А.К., Козлов А.С., Малышкин СБ. и др. Использование субмиллиметрового излучения лазера на свободных электронах (ЛСЭ) Сибирского центра фотохимических исследований для неразрушающего перевода в аэрозольную фазу сложных молекулярных систем различного происхождения // «СИ-2006»: XVI международная конференция по использованию синхротронного излучения. Новосибирск, 2006. С. 12.
11. Тонгур B.C. Биологически активные вещества. М., 1960. 39 с.
12. Psomiadou E., Tsimidou M. Simultaneous HPLC Determination of Tocopherols, Carotenoids, and Chlorophylls for Monitoring Their Effect on Virgin Olive Oil Oxidation // J. Agric. Food Chem. 1998. V. 46. Pp. 5132-5138.
13. Кожанова Л. А., Федорова Г. А., Барам Г.И. Определение во до- и жирорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах методом ВЭЖХ // Журнал аналитической химии. 2002. Т. 57, №1. С. 49-54.
14. Davies B.H. Analysis of carotenoid pigments // Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments. London: Academic Press. 1965. Pp. 183-230.
15. A.c. №1578651 (СССР). Способ определения полифенольных соединений в водных и водноспиртовых экстрактах / СИ. Писарева, В.Н. Буркова, Г.И. Калинкина // Б.И. 1990. №26. С. 204.
16. Зуева Е.П., Рейхарт Д.В., Крылова С.Г. и др. Лекарственные растения в терапии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Томск, 2003. 157 с.
17. Li Guodong, Xiong Xiang, Huang Boyun. Zhongnan daxue xuebao // Ziran kexue ban=J. Cent. S. Univ. Sci. and Technol. 2004. V. 35, N4. Pp. 527-531.