ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА ЭКСТРАКЦИИ ФУКОИДАНА ИЗ БУРОЙ ВОДОРОСЛИ FUCUS EVANESCENS. Т.И. Имбс, В.И. Харламенко, Т.Н. Звягинцева Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, пр. 100 лет Владивостоку, 159, Владивосток Институт биологии моря им. А.В. Жирмундского ДВО РАН, ул. Пальчевского, 17, Владивосток

Изучено влияние технологических факторов на процесс экстракции сульфатированного полисахарида - фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens. Определены оптимальные условия процесса, обеспечивающие выход однородного по составу фукоидана (сульфатированного фукала), который составил 79% от исходного. Использование мембранной ультрафильтрации позволило повысить доброкачественность конечного продукта до 87%.

Введение. Бурые водоросли, которыми богаты моря Дальнего Востока России, являются источниками уникальных по структуре и биологическому действию веществ, и наибольший интерес среди них в настоящее время представляют сульфатированные полисахариды - фукоиданы. Фукоиданы - довольно разнородная группа сульфатированных гетерополисахаридов - от полисахаридов с высоким содержанием уроновых кислот и низким содержанием фукозы и сульфата до практически чистых сульфатированных a-L-фуканов [1]. Это многообразие фукоиданов подразделяется на несколько структурных типов: фуканы, фукогалактаны, аскофиланы, саргассаны и другие менее распространенные структурные типы. Один вид водоросли может синтезировать фукоиданы, имеющие разное строение [2]. В последние годы активно изучается проявляемая фукоиданами разносторонняя биологическая активность и рассматривается возможность их использования в медицине [3]. Вместе с тем анализ литературы показал, что варьирование состава, молекулярной массы, содержания и положения сульфатных групп приводит к изменению целого ряда биологических свойств этих полисахаридов [4, 5].

Фукоидан - кислый полисахарид, поэтому легко экстрагируется из водоросли водой или водными растворами кислот. Вместе с фукоиданом экстрагируются другие водорастворимые полисахариды, такие как ламинаран и растворимые уронаны, а также низкомолекулярные вещества различной природы. Ранее были предложены условия для извлечения фукоидана из Pelvetia canaliculata и Fucus vesiculosus раствором соляной кислоты [6], горячей водой из Ecklonia kurome [7], а также дополнительной очистки фукоидана на стадии выделения [8]. В этих работах, как правило, определяли условия экстракции фукоидана, в то же время работ, в которых изучалось влияние условий экстрагирования на состав фукоидана, крайне мало [9]. Очевидно, что для успешных структурных и фармакологических исследований необходимо разработать условия получения стандартизованного препарата.

С практической точки зрения как источник фукоидана, представляющего собой практически чистый сульфатированный фукан, привлекательна бурая водоросль Fucus evanescens C.Ag. В дальневосточных морях эта водоросль имеет обширный ареал распространения, растет на мелководье и отличается высоким содержанием фукоидана [10].

Цель нашей работы - определение условий выделения однородного по составу фукоидана из бурой водоросли F. evanescens с наибольшим выходом.

Экспериментальная часть

В работе использовали свежесобранные и замороженные водоросли порядка Fucales: Fucus evanescens C.Ag., собранные на островах Итуруп и Парамушир (Охотское море) в августе 1996 и июле 2005 гг.

Водоросль предварительно обрабатывали спиртом этиловым дважды в течение 3 ч при температуре 40 °С, (водоросли : этанол, 1,0 : 0,8 m/m), высушивали и измельчали до размера частиц менее 0,5 см. Содержание фукоидана в сухой обезжиренной водоросли составляло 14%. Содержание фукоидана в водоросли выявляли после ее гидролиза 1N TFA спектрофотометрически по методике, используя фукозу как стандарт [10]. Содержание фукоидана во фракциях водорастворимых полисахаридов - спектрофотометрически, измеряя интенсивность окраски, получаемой после реакции L-фукозы с гидрохлоридом L-цистеина в присутствии концентрированной серной кислоты [11], содержание сульфатных групп определяли турбидиметрическим методом после кислотного гидролиза образцов фукоиданов [12].

Моносахаридный состав фукоиданов определяли после кислотного гидролиза методом ВЭЖХ на углеводном анализаторе IC-5000 Biotronik (Германия) (колонка 0,4 см × 25 см, смола Shimpack ISA-07/S2504, калий-боратный буфер, скорость элюции 0,6 мл/мин), обнаружение моносахаридов проводили бицинхонинатным методом. Моносахариды (Fuc, Gal, Xyl, Glc, Man, Rha) использовали как стандарты. Содержание уроновых кислот оценивали спектрофотометрически по реакции с 3,4-диметилфенолом и серной кислотой [13] при использовании D-глюкуроно-3,6-лактона (Sigma, США) в качестве стандарта.

Содержание экстрактивных веществ определяли по стандартной методике [14] (процент от веса сухой водоросли). Кислотный гидролиз фукоиданов. В ампулы помещали по 5 мг фукоидана, добавляли 0,5 мл 2N TFA, нагревали 6 ч при 100 °С.

Оптимизацию процесса экстракции фукоидана проводили с использованием математического метода планирования эксперимента по плану Бокса-Уилсона [15].

Для проверки значимости влияния факторов на процесс экстракции фукоидана был проведен оптимизационный эксперимент по типу дробной реплики с двумя уровнями пяти переменных (252). Независимыми переменными (Xi) были: X1 - значение рН; Х2 - кратность экстракций, раз; Х3 - продолжительность, ч; Х4 - температура, °С; Х5 - степень измельчения сырья, мм. Выход процесса Yi (функция отклика) определили как Y1 - выход фукоидана (процент от содержания в сырье); Y2 - выход экстрактивных веществ (процент от веса сырья); Y3 - выход водорастворимых полисахаридов (процент от веса экстрактивных веществ); Y4 - выход фукоидана (процент от веса водорастворимых полисахаридов). Для постановки опытов была выбрана четверть реплики с определяющими контрастами X1 X2 X4 = 1; X1 Х2 Х3 Х5 = -1; -Х3 Х4 Х5 = 1.

Основные переменные факторы эксперимента и уровни их варьирования для экстракции бурой водоросли F. evanescens

Переменные факторы Характеристика плана 

Значение рН,
X1 Кратность, раз,
Х2 Продолжительность, ч,
Х3 Температура, °С,
Х4 Степень измельчения, мм,
Х5 Основной уровень,
X (0) Шаг варьирования, Верхний уровень, X (+1) Нижний уровень, X (-1)
2,5 1,0 3,5 1,5 2,0 1,0 3,0 1,0 3,0 1,0 4,0 2,0 50 15 65 35 5 3 8 2

Результаты и их обсуждение

План и результаты факторного эксперимента приведены ниже. Для определения ошибки эксперимента было поставлено 4 опыта в нулевых условиях (опыты 9-12).

Проверка значимости коэффициентов при факторах Xi в уравнениях (1-4) по критерию Стьюдента (с надежностью 95 %) показала, что в уравнении (1) значимо отличны от нуля коэффициенты при Х2, Х4 и Х5, в уравнении (2) - при Х2, Х4 и наибольшее влияние оказывает фактор Х2 - кратность экстракции, а в уравнениях (3) и (4) - при Х1. Это означает, что в выбранных диапазонах величин увеличение кратности (Х2) и температуры экстракции (Х4) должно приводить к увеличению выхода фукоидана (Y1) и экстрактивных веществ (Y2). При увеличении рН среды (X1) следует ожидать повышения доли полисахаридов в экстрактивных веществах (Y3) и уменьшения доли фукоидана во фракции полисахаридов (Y4).

Как показали результаты регрессионного анализа уравнения (1), оно удовлетворительно описывает выход фукоидана в процессе экстракции.

Экспериментальная проверка модели в условиях иных, чем те, которые использовались для получения уравнения (1), подтвердила адекватность ее применения для описания процесса (F3Kcn = 5,42; Fv^n = 5,79; p = 0,05)

Сравнение выходов фукоидана YT (теория), рассчитанного теоретически по уравнению (1), и Y3(Эксперимент), полученного экспериментально при различных условиях экстрагирования бурой водоросли F. evanescens

№ Факторы эксперимента YT% * (теория) Y3% * опыта Х0 X1 х2 х3 х4 х5 (эксперимент)
1 1 : 15 1,5 3 4 65 2 81 79±1,2
2 1 : 15 2,5 2 4 65 8 82 81±0,8
3 1 : 15 3,5 3 3 50 5 68 70±1,9
4 1 : 15 2,5 3 4 65 2 79 79,5
5 1 : 15 2,5 3 4 65 8 93 89±1,5
* от содержания фукоидана в сырье, %

Уравнения дают представление о количественном влиянии каждого фактора на выход экстрактивных веществ, фукоидана, полисахаридов в процессе экстракции и показывают возможность управления этим процессом. Для масштабирования процесса экстракции фукоидана из F. evanescens необходимо учитывать следующие закономерности. На выход фукоидана положительно влияло увеличение кратности экстрагирования. Однако при многократном экстрагировании уменьшалась селективность экстракции.

Повышение температуры экстракции также положительно влияло на выход фукоидана, но учитывая, что экстрагирование проводят при достаточно низких значениях рН, повышение температуры выше 70 °С может привести к частичному кислотному гидролизу фукоидана. Поскольку уменьшение размера частиц сырья при статическом режиме экстракции не приводило к повышению выхода фукоидана, рекомендовано использовать сырье размера 1-2 см. Изменение рН в заданном интервале (1,5-3,5) значимо не влияло на выход фукоидана, но сказывалось на выходе фракции водорастворимых полисахаридов и содержание фукоидана в этой фракции. Этот момент важен при комплексной переработке водорослей, когда кроме фукоидана на последующих стадиях выделяют другие полисахариды. Варьируя значение рН от 1,5 до 3,5 и выше, можно получать фракцию полисахаридов с разным содержанием фукоидана и водорастворимых уронанов.

Для получения фракции полисахаридов, обогащенной фукоиданом, экстракцию следует проводить при низких значениях рН. В ходе дальнейших исследований был определен оптимальный режим экстрагирования по методу крутого восхождения по поверхности отклика с использованием уравнения (1). По результатам оптимизации были выбраны условия экстракции фукоидана: рН 2-2,5; 65±5 °С; три раза по 3 ч, гидромодуль 1 : 15. В этих условиях был получен фукоидан с выходом 81%.

Для определения качественного состава были исследованы экстракты каждой ступени экстрагирования. Характеристики экстрактов приведены по моносахаридному составу и содержанию сульфатов экстракты 1 и 2 практически не различались. В экстракте 3 значительно повысилась доля уронанов, а в составе моносахаридов - доля маннозы.

При детальном исследовании (неопубликованные данные) было определено, что экстракт 3 содержал фукоидан, обогащенный уронофукановой фракцией, в которой наряду с фукозой содержались большие количества глюкуроновой кислоты и маннозы. По-видимому, длительное экстрагирование при высоких температурах приводит к разрушению клеточных стенок водоросли и выделению фукоидана другого типа. При необходимости получения гетерогенного фукоидана можно проводить 3-ю экстракцию, выход которой составил 12 % от суммарного.

Содержание фукоидана в суммарном (после двух экстракций) экстракте составляло от 40 до 60%.
Для очистки фукоидана от ламинарана и низкомолекулярных примесей был использован метод мембранной ультрафильтрации.
Одновременно с очисткой экстракта происходило его концентрирование.

Конечный продукт получали осаждением фукоидана из концентрата этиловым спиртом.

Характеристики экстрактов и конечного продукта приведены ниже.

В результате очистки был получен полисахаридный препарат, содержащий 87% фукоидана.
Выход фукоидана (сульфатированного фукана) составлял до 79% от его содержания в сырье.

Характеристика экстрактов, выделенных из F. evanescens при рН 2,5; 65 °С; 3 ч

Характеристики Ступени экстракции экстракт 1 экстракт 2 экстракт 3
Выход фукоидана, %* Уроновые кислоты, %** Фукоидан, %** Сульфаты, %** 6,5 2,8 65,0 22,7 3,5 5,0 89,7 23,2 1,3 20,0 55,7 15,0

Характеристики экстрактов (до и после очистки на ультрафильтрационной установке) и конечного продукта из F. evanescens

Характеристика Исходный экстракт Концентрат Ультра-фильтрат Конечный продукт
Экстрактивные вещества, %* 25,4±1,1 14,7±1,2 11,7 12,1±0,9
Фукоидан, %* 10,9±0,3 10,7±0,6 0,2 10,5±0,6
Водорастворимые полисахариды, %* 13,4±1,0 12,6±0,7 0,8 11,3±0,8
Доброкачественность, %** 43 73 2 87
*- от веса сухой обезжиренной водоросли, %;
**- содержание фукоидана (от экстрактивных веществ, %).

Заключение

Изучен процесс выделения сульфатированного полисахарида - фукоидана из бурой водоросли F. evanescens. Установлено, что наибольшее влияние на выход фукоидана оказывали кратность экстракций и, в меньшей степени, температура экстракции, зависимость выхода фукоидана от этих параметров имела линейный характер.

В результате оптимизации технологических режимов экстракции фукоидана из F. evanescens установлено, что наибольший выход однородного по составу фукоидана (сульфатированного фукана) 79% достигался при температуре 65±5 °С, кислотности экстракционной среды рН 2,5; гидромодуле 1:15, при двукратной экстракции, продолжительностью каждая по 3 ч. При необходимости получения гетерогенного фукоидана можно проводить 3-ю экстракцию, выход которой составлял 12% от суммарного. Использование мембранной ультрафильтрации повышало доброкачественность конечного продукта до 87%.

Список литературы

1. Усов А.И., Билан М.И. Фукоиданы - сульфатированные полисахариды бурых водорослей // Успехи химии. 2009. Т. 78, №8. С. 846-862.
2. Имбс Т.И., Шевченко Н.М., Семенова Т.Л., Суховерхов СВ., Звягинцева Т.Н. Гетерогенность состава сульфатированных полисахаридов, синтезируемых бурой водорослью Costaria costata // Химия природных соединений. 2011. №1. С. 86-87.
3. Kusaykin M.I., Bakunina I.Yu., Sova V.V., Ermakova S.P., Kuznetsova T.S., Besednova N.N., Zaporozhets T.S., Zvyagintseva T.N. Structure, biological activity, and enzymatic transformation of fucoidans from the brown seaweeds // Biotechnol. J. 2008. V. 3, N7. Pp. 904-915.
4. Cumashi A., Ushakova N.A., Preobrazhenskaya M.E., D'Incecco A., Piccoli A., Totani L., Tinari N., Morozevich G.E., Berman A.E., Bilan M.I., Usov A.I., Ustyuzhanina N.E., Grachev A.A., Sanderson C.J., Kelly M., Rabinovich G.A., Iacobelli S. A comparative study of the antiinflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds // Glycobiology. 2007. V. 17. Pp. 541-552.
5. Hemmingson J.A., Falshaw R., H.Furneaux R, Thompson K. Structure and antiviral activity of the galactofucan sulfates extracted from Undaria pinnatifida (Phaeophyta) // J. Appl. Phycol. 2006. V. 18. Pp. 185-193.
6. Black W.A.P., Dewar E.D., Woodward F.N. Manufacture of algal chemicals. IV. Laboratoryscale isolation of fucoidin from brown marine algae // J. Sci. Food Agric. 1952. V. 3. Pp. 122-129.
7. Nishino T., Yokoyama G., Dobashi K. Isolation, purification and characterization of fucosecontaining sulfated polysaccharides from the brown seaweed Ecklonia kurome and their bloodanticoagulant activities // Carbohydr. Res. 1989. V. 186. Pp. 119-129.
8. Усов А.И., Чижов А.О. Полисахариды водорослей. Углеводный состав бурой водоросли Chorda filum // Биоорганическая химия. 1989. Т. 15, №2. С. 208-216.
9. Ponce N.M.A., Pujol C.A., Damonte E.B., Flores M.L., Stortz C.A. Fucoidans from the brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies // Carbohydr. Res. 2003. V. 338. Pp. 153-165.
10. Усов А.И., Смирнова Г.П., Клочкова Н.Г. Полисахариды водорослей. 55. Полисахаридный состав некоторых бурых водорослей Камчатки // Биоорг. химия. 2001. Т. 27, №6. С. 444–448.
11. Dische Z., Shettles L.B. A specific color reaction of methylpentoses and a spectrophotometric micromethod for theie determination // J. Biol. Chem. 1948. V. 175. Pp. 595-603.
12. Dodgson K.S. Determination of inorganic sulphate in studies on the enzymatic and nonenzymatic hydrolysis of carbohydrate and other sulphate esters // Biochem. 1961. V. 78, N2. Pp. 312-319.
13. Blumenkrantz N., Asboe-Hansen G. New method for quantitative determination of uronic acids // Anal. Biochem. 1973. V. 54. Pp. 484–489.
14. Настойки, экстракты, эликсиры и их стандартизация /ред. В.Л. Багирова, В.А. Северцев. СПб., 2001. 223 с.
15. Пономарев В.Д. Экстрагирование лекарственного сырья. М., 1976. 204 c.