БИОХИМИЧЕСКОЕ И АНАТОМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ AMARANTHUS HYPOCHONDRIACUS L* А.В. Молчанова, Е.Ю.Бабаева всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур (ВНИИССОК), Селекционная, 14,п/o Лесной Городок, Одинцовский район, Московская область, Российский университет дружбы народов (РУДН), ул. Миклухо-Маклая, 6,Москва (Россия)

Впервые проанализирована динамика накопления сухого вещества, водорастворимых антиоксидантов и каротиноидов в листьях Amaranthus hypochondriacus L. сорта Крепыш. Изучено анатомическое строение листа, стебля и соцветия. Выявлены анатомические диагностические признаки, позволяющие отличить Amaranthus hypochondriacus L. от A. tricolor L.

Введение
В последнее время проводятся обширные исследования листьев растений рода Amaranthus L. как растительного сырья, обладающего богатейшим спектром вторичных метаболитов, которые проявляют биологическую активность [1]. Кроме того, растения амаранта отличаются высокой продуктивностью. Поэтому актуальным становится изучение динамики накопления физиологически активных веществ, проявляющих антиоксидантные свойства. Важнейшими соединениями-антиоксидантами в растительном сырье являются каротиноиды, аскорбиновая кислота, восстановленный глутатион, а-токоферол, флавоноиды и изопреноиды. Все эти соединения способны неферментативно или с помощью ферментов нейтрализовать активные формы кислорода (АФК), или свободные радикалы, возникающие в результате контакта АФК с мембранами [2].
Известно, что биохимический состав и содержание отдельных его компонентов в листовой массе растений зависит не только от вида и фазы развития растений, но и от условий их произрастания, в частности погодных условий вегетационного периода. Это важно учитывать при разработке требований к получаемому сырью для свежего потребления или заготовки для переработки на фиточаи. Исследования биохимического состава листьев амаранта Amaranthus hypochondriacus L. были проведены в 2009 и 2010 гг., погодные условия которых резко различались по влажностному и температурному режимам.
Существует несколько видов рода Amaranthus L., сырье которых широко используется, несколько различаясь по хозяйственно ценным показателям, в частности A tricolor L. [3]. При использовании листьев для производства фиточаев их высушивают, при этом многие внешние признаки утрачиваются. Следовательно, важно найти критерии, по которым можно будет отличать различные виды. Таким дополнительным критерием могут стать особенности анатомического строения высушенных листьев. Это позволит устанавливать подлинность надземной части A hypochondriacus L. в отличие от A tricolor L.

Экспериментальная часть
Исследования проводили на растениях амаранта Amaranthus hypochondriacus L. сорта Крепыш селекции ВНИИССОК в 2009-2010 гг. Имелись образцы высушенной травы A. tricolor. Амарант выращивали как однолетнее растение в условиях Московской области. Семена высевали в открытый грунт в четвертой декаде мая. Биохимические исследования проводили в отделе физиологии и биохимии растений ВНИИССОК. Содержание сухого вещества [4], суммы водорастворимых антиоксидантов, аскорбиновой кислоты [5] и каротиноидов в листьях амаранта сорта Крепыш определяли на трех фенологических фазах развития растений: вегетативного нарастания (фаза 10 настоящих листьев), бутонизации и созревания семян.
Определение фотосинтетических пигментов проводили спектрофотометрическим методом [6, 7]. Определение суммарного содержания водорастворимых антиоксидантов (ССА) осуществляли на измерительном комплексе «ЦветЯуза-01-АА» амперометрическим способом [8] по модифицированной нами методике, разработанной для овощных культур. Листья амаранта со средней части яруса (физиологически зрелые) 20 растений (общей массой не менее 5 г) собирали в утренние часы, укладывали в полиэтиленовые пакеты. Заготовленные листья промывали дистиллированной водой, подсушивали между листами фильтровальной бумаги в течение 10 мин, проводили предварительное измельчение вручную или на лабораторном гомогенизаторе и отбирали средние пробы массой 0,6500±0,0200 г в трехкратной повторности (взвешивали на аналитических весах), каждую из которых растирали в фарфоровой ступке с 5 мл бидистиллированной воды.
Растертую листовую биомассу помещали в мерный цилиндр и доводили объем пробы до 50 мл би-дистиллированной водой, перемешивали, экстрагировали в течение 2-5 мин и фильтровали через бумажный фильтр «Синяя лента». 1-2 мл полученного фильтрата с помощью медицинского шприца вводили в петлю аналитической ячейки прибора для проведения измерений. При необходимости исследуемый фильтрат разбавляли, чтобы регистрируемый сигнал находился в диапазоне калибровочной кривой. Перед сбором растительного материала проводили следующие операции: приготовление элюента, приготовление маточного и калибровочных растворов галловой кислоты, на измерении сигналов которых строили калибровочный график. Стандартом для ее построения являлся раствор галловой кислоты в диапазоне 0,2-4,0 мг/дм3. Исходя из калибровочной кривой рассчитывали суммарное содержание антиоксидантов (ССА) в образцах в единицах концентрации галловой кислоты (ЕГК).
Исследования анатомического строения сухих листьев различных образцов амаранта A. hypochon-driacus L. и A. tricolor L. проводили на кафедре ботаники, физиологии растений и агробиотехнологии РУДН. При получении микропрепаратов руководствовались требованиями общей статьи Государственной фармакопеи СССР XI издания [9]. Микрофотографии сделаны на микроскопе ЛОМО Микмед 1 с бинокуляром АУ-12 1,5× (окуляр 10×, объективы 8×, 10×, 20×, 40×) с помощью цифровой камеры Canon Power Shot A450 и отредактированы в программе Adobe Photoshope CS3.
Полученные данные обработаны методом дисперсионного анализа, а также с использованием статистического пакета STATISTICA 5.5 для ПЭВМ.

Обсуждение результатов
Содержание сухого вещества является важнейшим показателем оценки качества растительного материала. Его определение в растительных объектах тождественно степени оводненности [4], которая в свою очередь в определенной мере зависит от особенностей водного режима и в открытом грунте связана с количеством выпавших осадков. В условиях влажного 2009 г. содержание сухого вещества в листьях амаранта (рис. 1) оставалось примерно на одном уровне, с тенденцией к небольшому увеличению от фазы вегетативного нарастания к фазе созревания семян. Величина этого показателя в 2009 г. достоверно отличалось от такового в 2010 г. лишь в фазу бутонизации (18,74±0,28 и 23,63±0,16 соответственно), тогда как в других фазах онтогенеза достоверной разницы по годам не наблюдали. Максимальное содержание сухого вещества в сырье в фазу бутонизации в 2010 г. можно объяснить усиленной транспирацией в условиях аномально высокой температуры и низкой влажности воздуха, установившихся в Московской области в июле-августе: +30-35 °С и 40-60% соответственно.
Любой организм имеет антиоксидантную систему, состоящую из высокомолекулярных соединений (ферментов) и низкомолекулярных, которые, в свою очередь, подразделяются на водо- и жирорастворимые антиоксиданты [2]. Поэтому для оценки сырья по биохимической ценности было измерено суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов (ССА) в листьях амаранта A. hypochondriacus L. сорта Крепыш на разных фенофазах и количество аскорбиновой кислоты, функции которой в метаболизме растений чрезвычайно разнообразны, в том числе и в системах антиоксидантной защиты (рис. 2 и 3).
Содержание антиоксидантов в изучаемом объекте в процессе онтогенеза претерпевало значительные изменения (рис. 2). Минимальную концентрацию водорастворимых антиоксидантов отмечали в фазу вегетативного нарастания как в 2009, так и в 2010 гг. (0,052±0,009 и 0,65±0,05 мг/г в ЕГК, соответственно), а максимальную - в фазу созревания семян (1,98±0,10 и 4,51±0,12 мг/г в ЕГК соответственно). Однако в 2010 г. суммарное содержание антиоксидантов в листьях амаранта на всех фазах развития было в два раза выше, чем в 2009 г.
Накопление в листьях аскорбиновой кислоты в 2009 г. имело схожую динамику с ССА, достоверно возрастая от фазы вегетативного нарастания к фазе созревания семян (от 21±3 до 118±8 мг%), но было иным в 2010 г. (рис. 3). Максимальное содержание аскорбиновой кислоты в листьях амаранта в 2010 г. отмечено в фазу бутонизации (114±8 мг%), когда растения находились в условиях высокотемпературного стресса и засухи. Однако в фазы вегетативного нарастания и созревания семян содержание аскорбиновой кислоты в 2010 г. было достоверно ниже по сравнению с 2009 г.
По-видимому, образование большого количества аскорбиновой кислоты в листьях амаранта связано с тем, что данное соединение окисляется как в результате прямого контакта с активными формами кислорода, возникающего в различных стрессовых условиях (июнь-июль 2010 г., август-сентябрь 2009 г.), так и участвуя в функционировании многих антиоксидантных систем, находящихся в хлоропластах в качестве восстановителя (например, в реакции деэпоксидации виолоксантина в виолоксантиновом цикле), митохондриях и пероксисомах.

Жирорастворимыми соединениями-антиоксидантами являются каротиноиды, которые относятся к многочисленной и широко распространенной в живой природе группе пигментов терпеноидной природы. Роль каротиноидов, как находящихся в тилакоидах хромопластов, так и экстратилакоидных, заключается в тушении возбужденных (триплетных) состояний синглетного кислорода [10, 11]. Особенностью каротиноидов является большое количество ненасыщенных сопряженных двойных связей, что обусловливает наличие у этих соединений электронно-донорных и электронно-акцепторных свойств [2]. При анализе коллекционных образцов амаранта ВНИИССОК было выявлено, что образцы амаранта из Индии, Бангладеш и Израиля содержали в листьях наибольшее количество каротиноидов и хлорофиллов [12].
На содержание каротиноидов в листьях растений амаранта сорта Крепыш в течение вегетации влияли условия года (рис. 4).

Динамика накопления каротиноидов в листьях амаранта в процессе онтогенеза (по фазам развития) в оба года исследований была схожа, но имела иной характер, чем у водорастворимых антиоксидантов. Причем содержание каротиноидов в листьях на всех фазах развития в 2009 г. было существенно выше, чем в 2010 г., что, возможно, объясняется высокими летними температурами и интенсивной инсоляцией, в условиях которых каротиноиды активно используются растением в качестве фотопротекторов.
Кроме того, было показано, что скорость деэпоксидации виолоксантина прямо зависит от изменения жидкостности мембраны, вызванного температурным воздействием. Увеличение жидкостности тилакоидной мембраны при низкой температуре благодаря каротиноидам может защищать растение от стресса при охлаждении [13-15].

Таким образом, сбор листьев амаранта для свежего потребления можно проводить в течение всего периода вегетативного нарастания до фазы цветения, а для заготовки сырья на переработку - от фазы бутонизации до цветения.
Одним из критериев установления подлинности растительного сырья является микроскопическое исследование с выявлением диагностических признаков. Нами было изучено анатомическое строение надземной части Amaranthus hypochondriacus в сравнении с A. tricolor по структуре. При рассмотрении листовой пластинки с поверхности видны клетки эпидермы на адаксиальной стороне с прямыми, на абаксиальной - с извилистыми стенками. Однослойная эпидерма начинает в онтогенезе дифференцироваться раньше, чем расположенные глубже ткани. [16, 17]. В мезофилле в клетках между жилками располагается много друз CaC2O4. Это характерные для семейства Amaranthaceae крупные клетки, содержащие обычно по одной друзе. Эти клетки в онтогенезе образуются из клеток адаксиального среднего слоя перипластической пластинки и располагаются примерно посередине между жилками [17]. В паренхимных клетках средней и крупных боковых жилок CaC2O4 откладывается в виде кристаллического песка (см. электронное приложение).
Трихомы представлены головчатыми волосками с многоклеточной ножкой и одноклеточной головкой. В анатомическом строении листа A. tricolor такого не найдено. Развитие волоска начинается с образования одной из протодермальных клеток бугорка и последующего тангентального деления [18]. В поперечном срезе черешка листа заметны два боковых тяжа хлоренхимы, разделенные участками 2-3-трехслойной колленхимы. [17]. Коллатеральные проводящие пучки располагаются на дистальной части черешка по дуге. Иногда на эпидермисе черешка встречаются трихомы и устьица. Основание черешка их не имеет, а колленхима образует сплошное кольцо под эпидермой. Стебель такого же строения. В отличие от него, стебель A tricolor имеет непучковое строение. В ксилеме присутствуют лигнифицированные ткани.

Боковое соцветие - двойные многочленные дихазии, объединенные в цимоидное соцветие. Верхушечное соцветие - открытый брактеозный тирс [19]. Клетки эпидермиса прицветника вытянутые, с прямыми стенками. Встречаются трихомы в виде вздутых клеток эпидермиса (см. электронное приложение).

Заключение
Проведенные биохимические исследования позволили установить закономерности накопления сухого вещества, аскорбиновой кислоты, суммы водорастворимых антиоксидантов и каротиноидов в листьях Amaranthus hypochondriacus L. сорта Крепыш в зависимости от фенологических фаз и погодных условий Московской области для определения оптимальных фаз сбора листьев амаранта для свежего потребления и сырья на переработку. Выявлены анатомические диагностические признаки в надземной части Amaranthus hypochondriacus L. в отличие от A. tricolor: на эпидермисе присутствуют трихомы в виде головчатых волосков с многоклеточной ножкой и одноклеточной головкой; строение стебля пучковое.

Список литературы
1. Чиркова Т.В. Амарант-культура 21 века// Соровский образовательный журнал. 1999. №10. С. 22-27.
2. Полесская О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода. М., 2007. 139 с.
3. Гинс М.С., Гинс В.К. Физиолого-биохимические основы интродукции и селекции овощных культур. М., 2011. 128 с.
4. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош. Н.П. Методы биохимических исследований. Л., 1987. 430 с.
5. Сапожников В.В., Дорофеева Н.С. Определение содержания аскорбиновой кислоты в окрашенных растительных экстрактах йодометрическим методом // Консервная и овощеводческая промышленность. 1996. №5. С. 28-34.
6. Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes // Methods in enzymology. 1987. Vol. 148. Pp. 350-382.
7. Практикум по физиологии растений: 3-е изд. перераб. и доп. М., 1990. 271 с.
8. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Черноусова Н.П. Новый прибор для определения антиоксидантов в пищевых продуктах, биологически активных добавках, лекарственных препаратах, биологических жидкостях, косметических и химических продуктах ЦветЯуза-01-АА. М., 2006. 115 с.
9. Государственная фармакопея СССР. Вып. 1. Общие методы анализа. МЗ СССР - 11 изд., доп. М., 1987. 336 с.
10. Соловченко А.Е., Мерзляк М.Н. Экранирование видимого и УФ излучения как механизм фотозащиты у растений // Физиология растений. 2008. T. 55. C. 803-822.
11. Горюнова Ю. Д. Влияние экологических факторов на содержание в растениях некоторых антиоксидантов : автореф. дис… канд. биол. наук. Калининград, 2009. 26 с.
12. Кононков П.Ф., Гинс В.К, Гинс М.С. Амарант-перспективная культура XXI века. М., 1997. 158 с.
13. Латовски Д., Костецка-Гугала А., Стржалка К. Влияние температуры на деэпоксидацию виолаксантина: сравнение действия in vivo и в модельных системах// Физиология растений. 2003. Т. 50. №2. С. 194-199.
14. Стржалка К., А. Костецка-Гугала, Латовски Д. Каротиноиды растений и стрессовое воздействие окружающей среды: роль модуляции физических свойств мембран каротиноидами // Физиология растений. 2003. Т. 50. №2. С. 188-193.
15. Caldwell C.R. Effect of elevated manganese on the ultraviolet and blue light absorbing compounds of cucumber cotyledon and leaf tissues // Plant Nutrients. 1998. Vol. 21. N3. Pp. 435-445.
16. Тимонин А.К. Анатомия вегетативных листьев некоторых видов Amaranthus L. 2. Листовая пластинка, черешок, проводящая система листовой оси // Бюллетень Московского общества испытателей природы. Отделение биологии. 1984. Т. 89, вып. 6. С. 119-126.
17. Тимонин А.К. Некоторые особенности опушения стеблей видов Amaranthus L. в связи с их диагностикой // Биологические науки, 1984. №1 С. 61-67.
18. Тимонин А.К. Анатомия вегетативных листьев некоторых видов Amaranthus L. 1. Развитие // Бюллетень Московского общества испытателей природы. Отделение биологии. 1984. Т. 89, вып. 2. С. 82-88.
19. Федорова ТА. Морфолого-систематическое исследование щириц (Amaranthus L. Amaranthaceae Juss) Европейской России и сопредельных территорий : автореф. дис...канд. биол. наук. М., 1997. 18 с.