Рассмотрено влияние предварительной механической активации на выход процесса экстракции гиперицина из травы зверобоя. Показано, что при высокоинтенсивной обработке (более 5 Вт/г) происходит хрупкое измельчение расти-тельного сырья и деградация активных веществ. Найдены пороговые значения по интенсивности и времени обработки, позволяющие увеличить выход экстракции в 6 раз. При низкоинтенсивной обработке (1 Вт/г) измельчение приобретает более вязкий характер. Найдены условия, позволяющие увеличить выход гиперицина в 10 раз.
Введение
Тенденцией последних лет является применение механохимических методов в переработке возобновляемых видов сырья - продуктов растениеводства и животноводства, промышленно выращиваемых микроорганизмов, отходов лесоперерабатывающей промышленности, торфа [1-4]. Механохимия стала применяться в переработке растительного и другого биогенного сырья с целью получения биологически активных веществ - алкалоидов, органических кислот, гликозидов [5-8].
Трава зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) содержит в себе ряд нафтодиантроновых соединений, а именно: гиперицин, псевдогиперицин, протогиперицин, протопсевдогиперицин (рис. 1).
Основным из нафтодиантроновых соединений считается гиперицин. Впервые охарактеризовал гиперицин Брокман в 1951 г. [9], однако только сравнительно недавно было показано, что гиперицин обладает высокой биологической активностью. Последние два десятка лет проводится активное изучение и расширение рынка препаратов, полученных из экстрактов травы зверобоя. Научные и клинические исследования показали, что гиперицин и остальные нафтодиантроновые соединения, полученные из экстрактов травы зверобоя, проявляют антибиотическую [10], антивирусную и антиретровирусную активность [11], антистрессовый и антидепрессантный эффекты [12], обладают антиок-сидантной активностью [13].
Нафтодиантроновые соединения растворимы в большинстве органических растворителей, в воде гиперицин растворим только при щелочных значениях pH [14]. Молекула гиперицина содержит гидро-ксильные группы, способные к депротонированию. pKa гиперицина = 1,6-1,8, поэтому в щелочных рас-творах присутствует преимущественно соль гиперицина [15].
В инертной атмосфере в твердой фазе гиперицин устойчив до 320 °С. В растворе, как и большинство фенольных соединений, гиперицин и его аналоги легко вступают в реакции с кислородом воздуха и сво-бодными радикалами, что делает его крайне неустойчивым [16]. В жидких средах гиперицин деградирует со скоростью, в 2000 раз превышающей скорость деградации в твердой фазе, в воздушно-сухом сырье [17].
Объективные трудности в получении гиперицина приводят к тому, что Фармакопеей содержание гиперицина в жидких препаратах не регламентируется [18], в существующих препаратах содержание гиперицина неустойчиво [19].
Применение твердофазных механохимических методов переработки травы зверобоя может сущест-венно сократить потери гиперицина в ходе получения. Целью настоящей работы является исследование влияния условий механохимической обработки травы зверобоя и оптимизация на этой основе технологии получения препаратов гиперицина.
Экспериментальная часть
Реактивы и материалы.
В качестве исходного сырья использовались зверобой продырявленный, предоставленный Центральным ботаническим садом СО РАН, ГОСТ 15161-93, кислота аскорбиновая ква-лификации «ч.д.а.», гидроксид натрия квалификации «ч.д.а.».Механическая активация.
Навеску растительного сырья обрабатывали в активаторе центробежного типа - мельнице АГО-2 - в качестве мелющих тел использовались стальные шары диаметром 6 мм, загрузка шаров - 200 г на 10 г обрабатываемого вещества, расчетное ускорение ме-лющих тел - 200-600 м/с2, и аттриторе (ИХТТМ СО РАН, Новосибирск) - в качестве мелющих тел исполь-зовались стальные шары, диаметром 16 мм, загрузка шаров - 2000 г на 100 г обрабатываемого вещества, расчетная интенсивность обработки - 1 Вт/г. Время обработки составляло 1-20 мин.Получение водных экстрактов.
Навеску растительного сырья экстрагировали водой при отношении твердой фазы к жидкой 1/100 по массе в течение 1 ч при комнатной температуре. Полученный экстракт отфильтровывался на фильтре 0,45 мкм и использовался для последующих анализов.ВЭЖХ-анализ.
Анализ проводился на приборе Милихром А-02. В ка-честве сорбента использовался ProntoSil 120-5-C18. Элюция проводилась в градиентном режиме, элюент^4 - бидистиллированная вода, Б - ацетонитрил. Детекция осуществлялась фотометрически.Анализ размера частиц.
Анализ проводился на приборе Микросайзер 201 (ЗАО «Научные приборы» Санкт-Петербург). Расчет проводился в приближении сферических частиц с учетом массовой доли.Рентгено-фазовый анализ.
Анализ проводился с помощью прибора ДРОН-3 (Россия), использова-лось Cu Ka излучение.Обработка данных.
Каждый эксперимент проводился в пяти повторностях. Доверительный интер-вал рассчитывался для доверительной вероятности 0,9.Результаты и обсуждение
Устойчивость нафтодиантроновых соединений при высокоинтенсивной механической обработке.
Многие органические соединения, особенно сложного строения, неустойчивы в ходе интенсивной механической обработки. Целью эксперимента было определение условий механической обработки, в ко-торых деградация гиперицина не происходит или происходит в минимальной степени.
Интенсивная механическая обработка проводилась в мельнице - активаторе АГО-2 в различных ре-жимах. Температура образцов непосредственно после обработки не превышала 50 °С. Проводились исчер-пывающая экстракция образцов и анализ методом ВЭЖХ содержания гиперицина.
Гиперицин в матрице растительного сырья неустойчив при высоких ин-тенсивностях механической обработки (расчетное ускорение воздействующих тел - шаров 400-600 м/с2) и начинает разлагаться практически мгновенно. Практический интерес представляет поведение образца при интенсивности обработки 5 Вт/г (расчетное ускорение шаров - 200 м/с2, энегронапряженность -5 Вт/г). В данных условиях содержание гиперицина остается постоянным до порогового времени в 120 сек, после чего начинает падать.
Причины порогового поведения эффективности химических превращений в механохимических ре-акциях связывают с изменением кристаллической структуры обрабатываемых веществ [20]. Однако в на-шем случае значительного изменения кристаллической стуктуры не происходило. Ниже представлены результаты исследования структуры целлюлозной матрицы травы зверобоя.
Изменение кристаллической структуры целлюлозосодержащей матрицы при высокоинтенсивной механической обработке. Устойчивость кристаллической структуры целлюлозосодержащей матрицы при механической обработке с интенсивностью 5 Вт/г в течение 100 и 200 сек изучена методом рентгенофазо-вого анализа. Пример полученной рентгенограммы (100 сек) представлен ниже на рисунке 3. Вид дифрак-тограммы соответствует известному для кристаллической целлюлозы в матрице растительного сырья.
Для исходного растительного сырья индекс кристалличности, вычисленный по формуле Сегала [21] с учетом отношения интенсивностей Io и I1, составляет 52%, для растительного сырья, обработанного в течение 100 сек - 47%, при обработке 200 сек индекс кристалличности составляет 46%, что незначительно превышает ошибку метода. Видно, что существенного разупорядочения кристаллической структуры цел-люлозы не происходит. Такой процесс можно описать как преимущественно хрупкое разрушение ткани растительного сырья.
Влияние высокоинтенсивной механической активации на выход гиперицина. Для определения физи-ко-химических последствий высокоинтенсивной механической активации проведена экстракция образцов, полученных в различных условиях. Исходный образец и образец, механически обработанный без добавок, экстрагировались водой, 0,1 М раствором NaOH и выдерживались в малом объеме щелочи, после чего по-вторно экстрагировались водой. Данные анализа экстрактов методом ВЭЖХ представлены на рисунке 4.
Выход гиперицина при экстракции образцов, полученных при обработке с высокой интенсивностью: 1) исходное растительное сырье, экстракция водой; 2) исходное растительное сырье, экстракция щелочью; 3) исходное растительное сырье, выдерживание со щелочью, экстракция водой; 4) растительное сырье, механически обработанное без добавок, экстракция водой; 5) растительное сырье, механически обработанное без добавок, экстракция щелочью; 6) растительное сырье, механически обработанное без добавок, выдерживание со щелочью, экстракция водой; 7) растительное сырье, механически активированное со щелочью, экстракция водой
При сравнении образцов исходного растительного сырья и механически обработанных (1-4, 2-5, 3-6) видно, что механическая активация без добавок влияет на выход слабее, чем изменение условий последующей экстракции. Несмотря на уменьшение среднего размера частиц при обработке без щелочи с 580 до 170 мкм изменение выхода незначительно.
По-видимому, выдержка в растворе щелочи повышает эффективность двух первых стадий процесса экстракции - диффузии щелочи в растительную ткань и реакции нейтрализации.
Сравнительно высокий выход гиперицина обеспечили образцы, выдержанные со щелочью и экстра-гированные водой. При механической активации с твердой щелочью деградация гиперицина замедлена, как и реакция нейтрализации. Однако при добавлении воды к порошку продукта происходит быстрый процесс растворения реагентов и реакции нейтрализации с последующей диффузией из ткани. В результате выход экстракции из образца, механически активированного со щелочью, повышается в 6 раз по сравне-нию с экстракцией водой исходного растительного сырья.
Устойчивость нафтодиантроноеых соединений и матрицы растительного сырья при механиче-ской обработке малой интенсивности. Поскольку разрушение матрицы растительного сырья в случае обра-ботки в мельницах при 20 g протекает преимущественно хрупким образом, для проведения активации в услови-ях, главным образом, пластичного разрушения использовалась механическая обработка с относительно малой интенсивностью 1 Вт/г в.
Изменение температуры обработки может повлиять на механизм измельчения. Повышение темпера-туры обычно приводит к преимущественно пластичному разрушению твердых веществ. Механическая ак-тивация растительного сырья в аттриторе проведена при температурах -196, 10 и 98 °С. Специальными экспериментами показано, что температура внутри реактора после окончания обработки превышала температуру, задаваемую термостатирующими жидкостями, не более чем на 20 °С.
Для полученных образцов определялись содержание гиперицина, индекс кристалличности целлюлозы и распределение частиц по размерам.
Известно, что температура в значительной степени влияет на пластические свойства полимеров. Так, в наших экспериментах при обработке в аттриторе при температуре -196 °С индекс кристалличности цел-люлозы уменьшался незначительно, что свидетельствует о преимущественно хрупком разрушении, аналогично высокоинтенсивным условиям.
За 20 мин обработки происходит достоверное уменьшение содержания гиперицина. Так как гиперицин устойчив до 320 °С, то для термической деградации необходимо образование локальных областей с более высокой температурой, что маловероятно. В таком случае деградация может происходить непосредственно вследствие деструкции гиперицина под механическим воздействием либо из-за взаимодействия гиперицина со свободными радикалами, образующимися при разрыве связей в матрице растительного сырья.
При температуре обработки 10 °С достоверное уменьшение содержания гиперицина происходит за 15 мин обработки. Индекс кристалличности уменьшается только первые 10 мин, после чего его уменьше-ние резко замедляется. Падение индекса кристалличности при постоянстве содержания гиперицина свидетельствует о том, что в данном случае в условиях пластической деформации осуществляется эффективный отвод тепла, разложение гиперицина не наблюдается.
При температуре обработки 98 °С содержание гиперицина монотонно уменьшается во времени, замет-ное уменьшение происходит после 10 мин обработки. Индекс кристалличности целлюлозы при этом значи-тельно уменьшается в первые 5 мин обработки, после чего скорость падения уменьшается.
В данном случае разрушение также происходит по пластичному механизму, но температура в обра-батываемых областях достаточна для разложения гиперицина.
Влияние низкоинтенсивной механической активации на выход гиперицина. Для определения физико-химических последствий механической активации в аттриторе образцы после механической обработки со щелочью экстрагировались водой. Данные количественного анализа экстрактов методом ВЭЖХ представ-лены на рисунке 7.
Образцы, обработанные в АГО-2 и аттриторе при -196 °С разрушались хрупким образом. Однако уменьшение размера частиц по сравнению с другими образцами не привело к значимому увеличению вы-хода экстракции. Образец, обработанный при 10 °С, показал наибольший выход. Уменьшение диффузион-ных путей и облегчение диффузии за счет разупорядочения структуры привели к положительному результату. Следует заметить, что в данном случае в раствор выходит сразу солевая форма гиперицина, что уве-личивать скорость диффузии за счет повышения градиента концентраций.
Уменьшение выхода экстракции из образца, обработанного при 98 °С, связано со значительным увеличением размера частиц и увеличением диффузионных путей.
Выводы
1. Условия механохимической обработки травы зверобоя со щелочью влияют на эффективность экстракции полученного порошкового продукта водой: более высокий выход обеспечивает обработка сырья в условиях пластического разрушения при интенсивности механической обработки менее 5 Вт/г.
2. При снижении температуры обработки в условиях пластического разрушения с 10 до -196 °С и повышении температуры до 98 °С выход снижается.
3. С помощью механохимической активации со щелочью в оптимальных условиях выход гиперицина из растительного сырья увеличивается в 10 раз по сравнению с экстракцией необработанной травы зверобоя.
Список литературы
1. Горохова В.Г., Петрушенко Л.Н., Шишко, А.А., Чернова В.Г. Импульсная механохимическая обработка полимеров растительного происхождения // Доклады Академии наук. 1995. Т. 343. С. 62-64.
2. Ефанов М.В. О превращениях древесины осины и ее основных производных компонентов в реакции О-ацилирования//Химия природных соединений. 2001. Т. 5. С. 410–421.
3. Кашинская Т.Я., Гаврильчик А.П., Шевченко Н.В. Механохимические превращения гуминовых веществ торфа // Химия твердого топлива. 2003. №1. С. 21-29.
4. Иванов А.А., Савельева А.В., Юдина Н.В., Ломовский О.И. Изменение состава и свойств липидов торфов при механохимической обработке // Журнал прикладной химии. 2005. Т. 78, №3. С. 512-516.
5. Панкрушина Н.А., Ломовский О.И. Механохимическая твердофазная экстракция - новая эффективная технология выделения биологически активных веществ из лекарственного растительного сырья // Лесные биологически ак-тивные ресурсы : матер. междунар. семинара. Хабаровск, 2001. С. 125-130.
6. Королев К.Г. Механохимия карбоксил- и гидроксилзамещенных органических соединений и ее технологическое применение : автореф. … канд. хим. наук, Новосибирск, 2005. 24 с.
7. Pankrushina N., Lomovsky O., Boldyrev V. The new «green» methodology for isolation of natural products from medicinal plants utilizing a mechanochemical approach // Planta medica. 2007. V. 73, N9. P. 931.
8. Korolev K.G., Lomovsky O.I., Rozhanskaya O.A., Vasiliev V.G. Mechanochemical preparation of water-soluble forms of triterpenic acids // Chem. Natural Compounds. 2003. V. 39, N4. Pp. 366-372.
9. Brockmann H., Kluge F. Zur Synthese des Hypericins // Naturwiss. 1951. Bd. 38. S. 141.
10. Jayasuriya H., McChesney J.D., Swanson S.M., Pezzuto J.M. Antimicrobial and cytotoxic activity of rottlerin-tipe com-pounds from Hupericum drummondii // J. Nat. Prod. 1989. V. 52, N2. Pp. 325-331.
11. Meruelo et al. Therapic agent with dramatic antiretroviral activity and little toxicity at affective doses: Aromatic polycyclic diones hypericin and pseudohypericin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85, N14. Pp. 5230-5234.
12. Cervo L., Rozio M., Ekalle-Soppe C.B., Guiso G., Morazzoni P., Caccia S. Role of hyperforin in the antidepressant-like activity of Hypericum Perforatum extracts // Psychopharmacology. 2002. V. 164. Pp. 423–428.
13. Valentão P., Fernandes E., Carvalho F., Andrade P.B., Seabra R.M., Bastos M.D.L. Antioxidant Activity of Hypericum androsaemum Infusion: Scavenging Activity against Superoxide Radical, Hydroxyl Radical and Hypochlorous Acid // Biol. and Pharm. Bull. 2002. V. 25, N10. Pp. 1320-1323.
14. Hypericin. Safety data sheet: Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-3530, Santa Cruz, 2005. 3 p.
15. Altmann R., Falk H. Deprotonierungs- und Protonierungsgleichgewichte eines Hypericinderivates in wriger // Monatshefte Fur Chemie. 1997. V. 128, N6-7. Pp. 571-583,
16. Ang C.Y.W., Hu L., Heinze T.M. Instability of St. John’s Wort (Hypericum perforatum L.) and degradation of hyperforin in aqueous solutions and functional beverage // J. Agric. Food Chem. 2004. V. 52. Pp. 6156-6164.
17. Ломовский И.О., Королев К.Г. Экстракции гиперицина из травы зверобоя. Влияние механической активации на процесс экстракции // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья : матер. IV все-рос. конф. Барнаул, 2009. Кн. 2. С. 232-234.
18. Государственная Фармакопея СССР. Изд. 11, вып. 2. M., 1990. 385 с.
19. Draves A.H., Walker S.E. Analysis of hypericin and pseudohypericin content of commercially available St. John’s Wort preparations // Pharmacognosy. 2003. V. 10, N3. Pp. 114-118.
20. Болдырев В.В. Механохимия и механическая активация твердых веществ // Успехи химии. 2006. №7. С. 203-211.
21. Байклз Н., Сегал Л. Целлюлоза и ее производные. М., 1974. Т. 1. 499 с.
Lomovskiy I.O. INFLUENCE OF CONDITIONS OF THE MECHANICAL TREATMENT ON EXTRACTION OF HYPERICIN FROM THE ST. JOHN’S WORTH
Institution of solid state chemistry and mechanochemistry Siberian branch of Russian academy of science, Kutateladze str, 18, Novosibirsk (Russia)
Research and education center «Molecular design and enviromentely safe technologyes» Novosibisk State University, Pi-rogova str,. 2, Novosibirsk (Russia)
This article has a deal with effect of mechanochemical activation on the yield of extraction of hypericin from plant material. It was shown that in case of high energy activation ( more than 5 W/g) the main processes is brittle failure of plant material and degradation of active components. The threshold values of intensity and time of treatment was found. High intensity treatment can increase the yield of extraction of hypericin in 6 times. In case of low intensity treatment (1 W/g) the failure becomes more plastic. The treatment in optimal conditions can increase the yield of hypericin in 10 times.
Keywords: Hypericin, Mrchanochemically assisted extraction, St. John’s Worth, HPLC.
References
1. Gorohova V.G., Petrushenko L.N., Shishko, A.A., Chernova V.G. Doklady Akademii nauk, 1995, vol. 343, pp. 62-64. (in Russ.)
2. Efanov M.V. Himija prirodnyh soedinenij, 2001, vol. 5, pp. 410–421. (in Russ.)
3. Kashinskaja T.Ja., Gavril'chik, A.P., Shevchenko, N.V. Himija tverdogo topliva, 2003, no. 1, pp. 21-29. (in Russ.)
4. Ivanov A.A., Savel'eva A.V., Judina N.V., Lomovskij O.I. Zhurnal prikladnoj himii, 2005, vol. 78, no. 3, pp. 512-516. (in Russ.)
5. Pankrushina N.A., Lomovskij O.I. Lesnye biologicheski aktivnye resursy: materialy mezhdunarodnogo seminara. [Forest biologically active resources: proceedings of the International Seminar]. Habarovsk, 2001, pp. 125-130. (in Russ.)
6. Korolev K.G. Mehanohimija karboksil- i gidroksilzamewennyh organicheskih soedinenij i ee tehnologicheskoe prime-nenie: avtoreferat dissertacii kandidata himicheskih nauk. [Mechanochemistry carboxyl and gidroksilzameschennyh organic compounds and technological application dissertation of the candidate of chemical sciences], Novosibirsk, 2005, 24 p. (in Russ.)
7. Pankrushina N, Lomovsky O., Boldyrev V. Planta medica, 2007, vol. 73, no. 9, p. 931.
8. Korolev K.G., Lomovsky O.I., Rozhanskaya O.A., Vasiliev V.G. Chem. Natural Compounds, 2003, vol. 39, no. 4, pp. 366-372.
9. Brockmann H., Kluge F. Naturwiss, 1951, bd. 38, s. 141. (in German)
10. Jayasuriya H., McChesney J.D., Swanson S.M., Pezzuto J.M. J. Nat. Prod., 1989, vol. 52, no. 2, pp. 325-331.
11. Meruelo et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1988, vol. 85, no. 14, pp. 5230-5234.
12. Cervo L., Rozio M., Ekalle-Soppe C.B., Guiso G., Morazzoni P., Caccia S. Psychopharmacology, 2002, vol. 164, pp. 423–428.
13. Valentão, P., Fernandes, E., Carvalho, F., Andrade, P.B., Seabra, R.M., Bastos, M.D.L. Biol. and Pharm. Bull., 2002, vol. 25, no. 10, pp. 1320-1323.
14. Hypericin. Safety data sheet: Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-3530, Santa Cruz, 2005. 3 p.
15. Altmann R., Falk H. Monatshefte Fur Chemie, 1997, vol. 128, no. 6-7, pp. 571-583. (in German)
16. Ang C.Y.W., Hu L., Heinze T.M. J. Agric. Food Chem., 2004, vol. 52, pp. 6156-6164.
17. Lomovskij I.O., Korolev K.G. Novye dostizhenija v himii i himicheskoj tehnologii rastitel'nogo syrja: mate-rialy IV vse-rossijskoj konferencii. [New advances in chemistry and chemical engineering plant materials: Materials IV Russian Con-ference]. 2009, Barnaul, book 2, pp. 232-234. (in Russ.)
18. Gosudarstvennaja Farmakopeja SSSR. Izdanie. 11. [State Pharmacopoeia of the USSR. Edition. 11] Moscow, 1990, no. 2, 385 p. (in Russ.)
19. Draves A.H., Walker S.E. Pharmacognosy, 2003, vol. 10, no. 3, pp. 114-118.
20. Boldyrev V. V. Uspehi himii, 2006, no. 7, pp. 203-211. (in Russ.)
21. Bajklz N., Segal L. Celljuloza i ee proizvodnye. [Cellulose and its derivatives]. Moscow, 1974, vol. 1, 499 p. (in Russ.)