ДИНАМИКА СЕЗОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА, СТЕПЕНИ НЕНАСЫЩЕННОСТИ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И АКТИВНОСТИ АЦИЛ-ЛИПИДНЫХ ДЕСАТУРАЗ В ТКАНЯХ НЕКОТОРЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ПРЕДБАЙКАЛЬЯ
И.А. Граскова , Л.В. Дударева, М.А. Живетьев, А.В. Столбикова, Н.А. Соколова, В.К. Войников Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН,ул. Лермонтова,132, Иркутск (Россия)

Исследование межвидовой изменчивости состава жирных кислот в тканях листьев у четырех видов лекарственных растений, произрастающих в условиях Предбайкалья, показало, что этот состав имеет видоспецифичный характер. В составе ненасыщенных жирных кислот всех изученных видов преобладают полиненасыщенные жирные кислоты линолевая и а-линоленовая, что обусловливает высокие значения индекса двойных связей (до 2,25 у манжетки). Наряду с высокими значениями коэффициента ненасыщенности (до 4,72 у тысячелистника) этот факт свидетельствует о высоком потенциале холодоустойчивости изучаемых видов.
Анализ сезонных изменений в составе жирных кислот четырех видов лекарственных растений показал, что по мере снижения среднесуточной температуры происходит закономерное уменьшение содержания насыщенных и увеличение содержания ненасыщенных жирных кислот. Установлено, что изменения в жирнокислотном составе липидов и в уровне активности со9- и со3-десатураз в тканях листьев при адаптации к понижению среднесуточной температуры воздуха у исследуемых растений также имеют межвидовые отличия.
Полученные данные дают основание полагать, что высокий потенциал холодоустойчивости у изучаемых видов связан, среди прочего, с особенностями процессов биосинтеза жирных кислот в составе их липидов.

Введение
Известно, что адаптация растений к низкотемпературному стрессу, помимо хозяйственного аспекта, имеет большое экологическое значение, так как способность растений адаптироваться к конкретным условиям - это один из факторов, определяющих ареалы распространения диких видов, в том числе лекарственных растений, и возможность их интродукции [1]. Считается, что липиды клеточных мембран играют ключевую роль в процессах адаптации и формировании устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды, прежде всего к холоду. Эта устойчивость коррелирует с наличием в клеточных мембранах полиненасыщенных жирных кислот (ЖК) [2]. Известно также, что именно ненасыщенные жирные кислоты в структуре мембран определяют ее «текучесть». В существующей модели молекулярного механизма адаптации клеток к низким температурам первичная роль отводится мембранным липидам, в частности их способности к фазовым переходам в зависимости от температуры окружающей среды и ферментам десатуразам, катализирующим синтез ненасыщенных жирных кислот. В соответствии с этой моделью при снижении температуры уменьшается текучесть мембран, это приводит к усиленному синтезу десатураз в клетке, их активации и, как следствие, к ускорению синтеза полиненасыщенных жирных кислот в мембранных липидах [3]. В результате этих процессов текучесть мембран восстанавливается. Таким образом,
именно активность десатураз является одним из ключевых моментов в адаптации растений к низким температурам [4]. В частности, на растениях табака, трансформированных геном А9-ациллипидной десатуразы из термофильной цианобактерии Synechococcus vulcanus, показано, что под действием низкой температуры контрольные (нетрансформированные) растения обнаруживали более сильные повреждения по сравнению с генетически модифицированными [5, 6].
Кроме того, при гипотермии отмечают увеличение общего содержания липидов в клетках растений [6-8].
Известно, что у высших растений существуют значительные межвидовые различия по холодоустойчивости. Так, ранее авторами [9] были показаны существенные отличия в составе ненасыщенных жирных кислот липидов митохондриальных мембран у контрастных по холодоустойчивости представителей культурных (Zea Mays L.) и дикорастущих (Elymus sibiricus L.) злаков. У озимых злаков повышение концентрации ненасыщенных жирных кислот выявляли уже через 15 мин после действия закаливающей температуры 2 °С [10]. В зеленых частях растений отмечают увеличение содержания ненасыщенных жирных кислот -особенно линолевой и а-линоленовой, характерных для мембран хлоропластов. Способность клеток адаптироваться к низким температурам связывают с возможностью синтезировать de novo ненасыщенные жирные кислоты, в том числе линоленовую, которая повышает текучесть липидного бислоя и предотвращает фазовое разделение липидов под действием низких температур [11]. Несмотря на относительную изученность биохимических процессов, обеспечивающих адаптивные изменения липидного состава мембран отдельных видов культурных растений, таких как арабидопсис, табак и других, при действии низких температур, вопросы устойчивости и липидного метаболизма растений остаются малоисследованными. Этим объясняется особый интерес к подробному изучению механизмов низкотемпературной адаптации у растений, произрастающих в суровых климатических условиях, в том числе в Байкальском регионе. Исследование липидов растений, обитающих в условиях абиотических стрессов, представляет несомненный интерес как для выявления физиолого-биохимических механизмов адаптации растений, так и ресурсоведческих и селекционных целей. Для исследования были выбраны 4 вида лекарственных растений, характеризующиеся высокой холодоустойчивостью (вегетация при температуре, близкой к 0 °С) и хозяйственной ценностью. Анализ научной литературы показал, что если по химическому составу эфирных масел, алкалоидов, дубильных веществ этих видов растений имеются некоторые сведения, то их жирнокислотный состав практически не исследовался [12]. Логично предположить, что анализ жирнокислотного состава суммарных липидов из тканей исследуемых растений, а также оценка активности десатураз при действии низких температур будет способствовать лучшему пониманию их роли в формировании устойчивости растений к этому фактору.
В связи с этим целью представляемой работы был сравнительный анализ жирнокислотного состава общих липидов, степени ненасыщенности жирных кислот и активности ациллипидных десатураз в листьях четырех видов растений.

Экспериментальная часть
Объектом исследования служили листья 4 видов лекарственных растений из флоры Предбайкалья:
вероника дубравная - Veronica Chamaedrys L., семейство норичниковые - Scrophulariaceae;
манжетка обыкновенная - Alchemilla vulgaris L., семейство розоцветные - Rosaceae;
тысячелистник - Achillea sp., семейство сложноцветные - Asteraceae (Compositae);
одуванчик - Taraxacum sp., семейство сложноцветные - Asteraceae (Compositae);
собранные в пойме реки Выдринная, в шестистах метрах от уреза оз. Байкал, левый берег реки (стационар СИФИБРа).

Для жирнокислотного анализа отбирались средневзвешенные образцы в трех повторностях в различные сроки вегетации, с июля по сентябрь, с целью уменьшения возможных автолитических изменений фиксировали их в жидком азоте и растирали до получения гомогенной массы для экстракции липидов. Для работы использовали охлажденную лабораторную посуду и реактивы. Экстракцию липидов из тканей исследуемых объектов проводили с использованием системы растворителей хлороформметанолвода (1:2:0,8 v/v/v) в присутствии 1% ионола. Для удаления хлороформа из экстракта липидов использовали роторный испаритель RVO-64 (Чехия).
Для получения метиловых эфиров жирных кислот к экстракту липидов после удаления растворителя добавляли 1% метанольный раствор H2SO4 и нагревали на водяной бане при 55 °С в течение 30 мин. После охлаждения метиловые эфиры жирных кислот трижды экстрагировали гексаном. Гексановый экстракт концентрировали с помощью роторного испарителя и очищали метиловые эфиры жирных кислот методом ТСХ с использованием стеклянных пластинок с силикагелем марки КСК. В качестве проявителя применяли бензол. Анализ полученных метиловых эфиров жирных кислот проводили методом газожидкостной хроматографии с использованием хроматомасс-спектрометра 5973N/6890N MSD/DS Agilent Technology (США). Для разделения использовали капиллярную колонку HP-INNOWAX, (30 м × 250 мкм × 0,50 мкм). Неподвижная фаза - полиэтиленгликоль. Подвижная фаза: гелий, скорость потока газа 1 мл\мин. Температура испарителя 250 °С, источника ионов - 230 °С, детектора - 150 °С, температура линии, соединяющей хроматограф с масс-спектрометром, 280 °С. Диапазон сканирования - 41–450 а.е.м. Объем вводимой пробы - 1 мкл, разделение потоков 5 : 1. Хроматографирование выполняли в изократическом режиме при 200 °С. Регистрацию осуществляли по полному ионному току (режим SCAN). Идентификацию метиловых эфиров жирных кислот проводили с помощью расчета эквивалентной длины алифатической цепи (ECL). При необходимости использовали библиотеки масс-спектров NIST 05, Christie, а также сравнение времени удерживания со временами удерживания стандартных соединений. Относительное содержание жирных кислот определяли в весовых процентах от общего их содержания в исследуемом образце. Для оценки степени ненасыщенности жирных кислот в тканях листьев использовали индекс ненасыщенности (индекс двойной связи - ИДС)
ИДС=ХP j n/100,
гдеPj - содержание жирных кислот (вес. %)иn - количество двойных связей в каждой ненасыщенной кислоте.
Активность ациллипидных со9, со6 и со3 мембранных десатураз, участвующих в биосинтезе олеиновой, линолевой и а-линоленовой кислот, определялась из уравнений (1-3):
SDR = (%C18:1)/(%C18:0+%C18:1); (1)
ODR = (%C18:2 + %C18:3)/(% C18:1+% C18:2 + %C18:3); (2)
LDR = (%C18:3)/( % C18:2 + %C18:3). (3)
В таблицах представлены средние данные из трех-четырех биологических повторностей и их стандартные отклонения. Аналитическая повторность приведена одна, так как разница между тремя аналитическими повторностями не превышала 0,01%. Достоверность различий сравниваемых средних значений оценивали с помощью t-критерия (Р менее 0.05).

Обсуждение результатов
Результаты анализа химического состава жирных кислот исследуемых видов растений приведены в таблицах 1-4. Из представленных данных видно, что основной ненасыщенной кислотой у всех изучаемых видов была пальмитиновая (С16:0) кислота. Ее содержание составляло от 12,72% от суммы кислот у манжетки в сентябре, до 19,89% у вероники в августе и 34,29% у тысячелистника в июле. Кроме пальмитиновой кислоты, в тканях листьев обнаружены насыщенные жирные кислоты с 14, 15, 17, 20, 22, 23 углеродными атомами. Содержание каждой из них было невелико и составляло, за исключением стеариновой кислоты (С18:0), менее одного процента от суммы кислот. Следует отметить, что в тканях листьев манжетки содержится больше низкомолекулярных короткоцепочечных жирных кислот (С менее 16), чем у трех других видов.
В составе ненасыщенных жирных кислот липидов исследуемых видов были идентифицированы моноеновые, диеновые и триеновые жирные кислоты, образующие со9, 2со6 и 3со3 биосинтетические семейства жирных кислот с цис- конфигурацией двойных связей в цепи. Моноеновые жирные кислоты в составе липидов также включали в себя со7 и со5 жирные кислоты. Среди со9 моноеновых жирных кислот были идентифицированы: 1) олеиновая кислота, содержание которой у исследуемых видов варьирует в сентябре от 0,92 % (одуванчик) до 2,06 % (вероника), в августе от 0,9 % у тысячелистника до 2,52 у манжетки, в июле - от 2,2 (одуванчик) до 2,98 (вероника); 2) изомер пальмитоолеиновой кислоты 16:1со9, содержание которого составляло от 0,5 % у тысячелистника в июле до 2,70% у манжетки в августе.

Содержание (% вес) жирных кислот, суммы насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, коэффициент ненасыщенности и индекс двойных связей, стероил-десатуразное, олеоил-десатуразное и ленолеил-десатуразное отношения у тысячелистника в июле, августе и сентябре
Содержание (% вес) жирных кислот, суммы насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, коэффициент ненасыщенности и индекс двойных связей, стероил-десатуразное, олеоил-десатуразное и ленолеил-десатуразное отношения у одуванчика в июле, августе и сентябре
Содержание (% вес) жирных кислот, суммы насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, коэффициент ненасыщенности и индекс двойных связей, стероил-десатуразное, олеоил-десатуразное и ленолеил-десатуразное отношения у манжетки в июле, августе и сентябре
Содержание (% вес) жирных кислот, суммы насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, коэффициент ненасыщенности и индекс двойных связей, стероил-десатуразное, олеоил-десатуразное и ленолеил-десатуразное отношения у вероники в июле, августе и сентябре

У исследованных растений были обнаружены в небольшом количестве еще два изомера пальмито-леиновой кислоты 16:1со7 и 16:1ю5. Из семейства диеновых жирных кислот, в синтезе которой принимает участие со6 десатураза, была идентифицирована линолевая. У всех изученных растений ее содержание в июле было примерно в два раза выше, чем в августе и сентябре. При этом меньше всего линолевой кисло-ты отмечено у манжетки (14,13% в июле, 11,03% в августе и 11,62% в сентябре). Для одуванчика содержа-ние этой жирной кислоты составило 23,69% в июле, 18,73 и 15,53% соответственно в августе и сентябре. Больше всего ее в листьях тысячелистника (30,68, 16,46 и 19,92%) и вероники (31,64% в июле, 17,76% в августе и 18,96% в сентябре).
Триеновые кислоты представлены а-линоленовой кислотой, содержание которой было закономерно высоким у всех изучаемых видов и варьировало в июле от 23,67 у тысячелистника и 40,54% у вероники до 52,29% у одуванчика и 57,54% у манжетки. В августе содержание а-линоленовой кислоты возрастало у тысячелистника (58,41%), вероники (55,05%) и одуванчика (59,06%), а у манжетки недостоверно понижа-лось (52,66%). Наибольшее содержание этой кислоты у всех изученных видов растений наблюдали в сен-тябре - от 58% у тысячелистника и вероники до 62,45% у одуванчика и 66,4% у манжетки. Следует отме-тить, что у манжетки была идентифицирована также гексадекатрненовая кислота 16:3со3, которая не обна-ружена у трех других видов. Из представленных данных видно, что высокая степень ненасыщенности жирных кислот в тканях листьев всех 4 видов обусловлена в основном двумя кислотами - линолевой (со6) и а-линоленовой (со3), причем с осенним понижением температур наблюдается слабое уменьшение линолевой при заметном увеличении содержания а-линоленовой жирной кислоты. Известно, что именно био-синтез диеновых и триеновых кислот 18:2со6 и 18:3со3 обеспечивает устойчивость растений к низкой температуре. По-видимому, наибольший вклад в адаптацию исследуемых растений вносит триеновая а-лино-леновая кислота по сравнению с диеновой линолевой кислотой.
Индекс двойной связи - ИДС, интегральная величина, характеризующая степень ненасыщенности жирных кислот, и, по-видимому, связанный напрямую с устойчивостью растений к холоду, у всех исследуемых видов довольно высокий и варьирует от 1,90 в июле-августе до 2,25 в сентябре - за исключением тысячелистника, для которого ИДС в июле был равен 1,36, но в августе и сентябре составил 2,11 и 2,19 соответственно. Для сравнения: у теплолюбивой кукурузы этот показатель, по данным авторов [9], составляет от 1,07 до 1,45 для разных групп мембранных липидов. По данным авторов [13], индекс ненасыщенности жирных кислот в тканях проростков кукурузы и пшеницы составил 0,97 и 1,09 соответственно. Следует отметить, что содержание диеновых и триеновых кислот у исследуемых видов различается. Так, например, содержание линолевой кислоты у манжетки в полтора-два раза ниже, чем у других видов, в отличие от а-линоленовой, содержание которой больше у манжетки. За счет этого индексы двойной связи у разных растений различаются.
Данные, представленные в таблице 5, показывают изменение температурного режима в месте отбора проб (река Выдринная).
Среднемесячная температура воздуха в районе исследований имела следующие значения: июль -14,7 °С, август - 12 °С, сентябрь - 8 °С.
Как видно из представленных данных (табл. 1-4), степень ненасыщенности жирных кислот в тканях листьев четырех изучаемых растений закономерно изменяется в процессе вегетации. Во всех случаях по мере снижения среднесуточной температуры наблюдали снижение содержания насыщенных и увеличение содержания ненасыщенных жирных кислот. Этот факт подтверждается соответствующими изменениями коэффициента ненасыщенности (К) и индекса содержания двойных связей (ИДС). Индекс двойных связей, а он более полно, чем коэффициент ненасыщенности, характеризует степень ненасыщенности липидов, во всех случаях достоверно увеличивался по мере снижения температуры, за исключением манжетки в июле и августе, где было отмечено отсутствие достоверных различий. Возможно, это связано с наибольшим разнообразием состава жирных кислот, в том числе ненасыщенных, у этого вида. Как уже отмечалось выше, у манжетки обнаружены, хотя и в небольшом количестве, триеновая кислота с 16 углеродными атомами (16:3со3).

Изменение температурных данных воздуха и почвы в месте отбора проб (Выдрино)

Дата отбора проб / температура Июль Август Сентябрь
Минимальная температура воздуха, °С +8,1 +11,5 +2,7
Максимальная температура воздуха, °С +20,7 +18,9 +5,4
Среднесуточная температура воздуха, °С +15,1 +14,8 +4,1
Температура почвы (глубина 5 см), °С +17,8 +15,1 +5,2

Установлены также изменения в активности десатураз, связанные со снижением среднесуточной температуры. Исходя из вычисленных коэффициентов SDR, ODR и LDR, активность соответствующих десатураз (со9, со6 и со3) представленных видов имела различный уровень. Считается, что гены ациллипидной со9-десатуразы, обеспечивающей введение первой двойной связи, всегда работает на одном постоянном уровне. Однако, по крайней мере у тысячелистника, наблюдали достоверное увеличение соответствующего коэффициента по мере снижения среднесуточной температуры (значение SDR менялось от 0,46 до 0,63). При этом были обнаружены межвидовые различия в уровне активности этой десатуразы. Самой низкой эта активность была у манжетки, а самой высокой - у вероники. Возможно, это связано с большим содержанием у манжетки короткоцепочечных жирных кислот, которые, как известно, могут способствовать поддержанию текучести мембран на оптимальном уровне [14]. Олеил-десатуразное соотношение (ODR) на протяжении исследуемого периода вегетации у всех изучаемых видов характеризовалось высокими значениями (0,96-1,00), показывая тем самым, что олеиновая кислота С18:1со9 активно конвертируется ацил-липидной со6-десатуразой в лино-левую кислоту. Высокие значения олеил-десатуразного отношения указывает также на важную функциональную роль этой десатуразы в адаптации исследуемых видов к понижению температуры. Линолеил-десатуразные соотношения (LDR) в листьях исследуемых видов находятся в пределах от 0,44 (июль, тысяче-листник) до 0,85 (сентябрь, манжетка), другими словами, обнаружены межвидовые различия в уровне актив-ности со3-десатуразы. При этом динамика изменений этой активности у исследуемых видов одинакова - по мере снижения температуры уровень активности возрастает.

Выводы
Исследование межвидовой изменчивости состава жирных кислот в тканях листьев у четырех видов лекарственных растений, произрастающих в условиях Предбайкалья, показало, что этот состав имеет ви-доспецифичный характер. Это выражается в различном соотношении содержания основных ненасыщен-ных и насыщенных жирных кислот. В составе ненасыщенных жирных кислот всех изученных видов преобладают полиненасыщенные жирные кислоты - линолевая и а-линоленовая, что обусловливает высокие значения индекса двойных связей (до 2,25 у манжетки). Наряду с высокими значениями коэффициента ненасыщенности (до 4,72 у тысячелистника) этот факт свидетельствует о высоком потенциале холодоустой-чивости изучаемых видов.
Анализ сезонных изменений в составе жирных кислот четырех видов лекарственных растений пока-зал, что по мере снижения среднесуточной температуры происходит закономерное снижение содержания насыщенных и увеличение содержания ненасыщенных жирных кислот. Установлено, что изменения в жирнокислотном составе липидов и в уровне активности со9- и со3-десатураз в тканях листьев при адапта-ции к понижению среднесуточной температуры воздуха у исследуемых растений также имеют межвидовые отличия. В то же время со6-десатураза у всех видов работала на высоком уровне, изменяя свою актив-ность только на сотые доли ODR. Тем не менее такие изменения могут быть следствием существенных адаптационных перестроек жирнокислотного обмена.
Полученные данные дают основание полагать, что высокий потенциал холодоустойчивости у изу-чаемых видов связан, среди прочего, с особенностями процессов биосинтеза жирных кислот в составе их липидов.

Список литературы
1. Колесниченко А.В., Войников В.К. Белки низкотемпературного стресса растений. Иркутск, 2003. 196 с.
2. Лось Д.А. Молекулярные механизмы холодоустойчивости растений // Вестник РАН. 2005. Т. 75, №4. С. 338-345.
3. Ильинская Л.И., Озерецковская О.Л. Продукты липоксигеназного окисления жирных кислот как сигнальные молекулы в индуцированной устойчивости растений (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. Т. 34, №5. С. 467–479.
4. Лось Д.А. Структура, регуляция экспрессии и функционирование десатураз жирных кислот // Успехи биологической химии. 2001. Т. 41. С. 163-198.
5. Попов В.Н., Орлова И.В., Кипайкина Н.В., Серебрийская Т.С, Меркулова Н.В., Носов A.M., Трунова Т.М., Цыдендамбаев В.Д., Лось Д.А. Влияние трансформации табака геном Д9-ацил-липидной десатуразы из Synechococcus Vulcanus на устойчивость растений к низкой температуре // Физиология растений, 2005. Т. 52. С. 747-750.
6. Трунова Т.И. Растение и низкотемпературный стресс. М., 2007. 54 с.
7. Хочачка П., Сомеро Д. Стратегия биохимической адаптации. М., 1977. 392 с.
8. Хочачка П., Сомеро Д. Биохимическая адаптация. М., 1988. 568 с.
9. Макаренко СП., Константинов Ю.М., Хотимченко СВ., Коненкина Т.А., Арзиев А.Ш. Жирнокислотный состав липидов митохондриальных мембран у представителей культурных (Zea mays) и дикорастущих (Elymus sibiricus) злаков // Физиология растений. 2003. Т. 50, N4. С. 548-553.
10. Новицкая Г.В., Сальникова Е.Б., Суворова Т.А. Изменение ненасыщенности жирных кислот липидов растений озимой и яровой пшеницы в процессе закаливания // Физиология и биохимия культурных растений. 1990. Т. 22. С. 257-264.
11. Vereshchagin A.G., Trunova T.I., Shayakhmetova I.S., Tsydendambaev V.D. On the role of cell membrane lipids in cold hardening of winter wheat leaves and crowns. // Plant. Physiol. Biochem. 1990. V. 25. Pp. 623-630.
12. Андреева В.Ю., Калинкина Г.И. Исследование химического состава надземной части манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L.S.L. // Химия растительного сырья. 2000. №2. С. 79-85.
13. Дударева Л.В., Рудиковская Е.Г., Шмаков В.Н., Арзиев А.Ш., Коненкова Т.А., Саляев Р.К. Особенности действия низкоинтенсивного лазерного излучения на мембраны растительных клеток и клеточных структур. Иркутск, 2009. С. 142-145.
14. Алаудинова Е.В., Миронов П.В. Липиды меристем лесообразующих хвойных пород Центральной Сибири в условиях низкотемпературной адаптации. 2. Особенности метаболизма жирных кислот фосфолипидов меристем Larix sibirica LEDEB., Picea obovata L. и Pinus silvestris L. // Химия растительного сырья. 2009. №2. С. 71-76.