Sophora flavescens, Fabaceae, флавоноиды, ценопопуляции, динамика накопления

ФЕНОЛЫНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ SOPHORA FLAVESCENS SOLAND., ПРОИЗРАСТАЮЩЕЙ В РОССИИ
Д.Н. Олейников,Л.М. Танхаева, Н.А. Панкрушина, Д.В. Санданов Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ (Россия) Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН, пр. Акад. Лаврентьева, 9, Новосибирск (Россия)

Исследован качественный состав и количественное содержание фенольных соединений подземной и надземной частей Sophora flavescens Soland. (семейство Fabaceae), произрастающей в России (Забайкальский, Приморский края, Агинский Бурятский автономный округ). Из корней с корневищами выделены кушенол А, изокураринон, кураридин софорафлаванон G, кураринон, изоксантогумол, умбелиферон и впервые - скополетин, феруловая, кофейная и хлоро-геновая кислоты. В составе фенольных соединений травы S. flavescens выявлено присутствие цинарозида, космосиина, кофейной кислоты и впервые - апигенина, лютеолина, кверцетина, умбеллиферона, рутина, хлорогеновой и неохлоро-геновой кислот. Доминирующими соединениями подземных органов являются кураринон и софорафлаванон G, над-земной части - цинарозид и рутин. Исследование характера накопления флавоноидов в подземных органах S. flavescens показало, что максимальное содержание характерно для эпидермальных слоев корневищ. Изучена дина-мика накопления флавоноидов в S. flavescens.

Введение
Софора желтоватая (Sophora flavescens Soland.) - многолетнее лекарственное растение семейства бобовых (Fabaceae), широко применяющееся в практике различных медицинских систем восточных стран. К настоящему времени имеются сведения об около ста соединениях фенольной природы, выделенных из S. flavescens, среди которых обнаружены халконы, флаваноны, флаванонолы, изофлавоны, птерокарпа-ны, бензохиноны, бензофураны, кумарины, феноло-кислоты и пренилбензоильные производные [1]. Наиболее изученными являются фенольные соединения подземных органов S. flavescens; данные о соста-ве фенолов надземной части данного вида немного-численны [2]. В количественном отношении в под-земных органах данного вида растительного сырья преобладают пренилированные флаваноны и халконы. Флавоноиды S. flavescens, согласно данным литературы, обладают выраженной биологической активностью и наряду с алкалоидами, тритерпеновыми соединениями и полисахаридами считаются действую-щими веществами данного растительного вида [1, 3-5]. Изучение состава фенольных соединений S. flavescens российского происхождения ранее не проводилось.
Целью настоящей работы является исследование качественного состава и количественного содер-жания фенольных соединений S. flavescens, произрастающей в России.

Экспериментальные условия
Растительное сырье. Корни и надземная часть S. flavescens были собраны в 2006-2009 гг. в Забай-кальском и Приморском краях и Агинском Бурятском автономном округе (табл. 1). Видовая принадлеж-ность определена одним из соавторов Д.В. Сандановым. Образцы сырья хранятся в гербарии Отдела биологически активных соединений ИОЭБ СО РАН.
Общие экспериментальные условия. Колоночную хроматографию (КХ) проводили на силикагеле (Chemapol, 100/400), Сефадексе LH-20 (Pharmacia), ТСХ - на пластинах с силикагелем Сорбфил ПТСХ-АФ-В (Имид Ltd.); системы растворителей: CHCl3 - EtOH 9 : 1 - 1, 4 : 1 - 2, 3 : 1 - 3; детектор - 0,5% рас-твор анисового альдегида в смеси МеОН - АсОН - Н3РО4 85 : 10 : 5. Спектрофотометрические исследова-ния проводили на спектрофотометре СФ-2000 (Ломо). МС-анализ проводили на масс-спектрометре высокого разрешения MAT 8200 (Finnigan). Спектры 1Н- и 13С-ЯМР регистрировали на ЯМР-спектрометре VXR 500S (Varian) с рабочей частотой 125.7 МГц. ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе Summit (Dionex). В ходе анализа определялись хроматографическая подвижность, спектр в остановленном потоке растворителя, спектральные соотношения, а также проводились опыты с добавками стандартных соединений. В работе использованы стандартные образцы веществ: апигенина, лютеолина, кверцетина, умбелифе-рона, скополетина, рутина, феруловой, кофейной кислот (Sigma), цинарозида, космосиина, хлорогеновой и неохлорогеновой кислот (ChromaDex); остальные реактивы имели степень чистоты ч.д.а.

Характеристика сырья S. flavescens
№ сырья Место сбора Дата сбора (ДД.ММ.ГГ)
Забайкальский край
G-0602, G-0803 с. Георгиевка 9.06.2002, 6.08.2003
NzI-0602, NzI-0803 с. Нерчинский Завод (ЦП I) 24.07.2001, 11.07.2002
NzII-0602, NzII-0803 с. Нерчинский Завод (ЦП II) 26.06.2002, 2.08.2003
Zp-0702 пос. Запокровский 4.07.2002
Агинский Бурятский автономный округ (АБАО)
A-0800, A-0701, A-0702, A-0802, A- с. Ага 24.08.2000, 25.07.2001, 6.07.2002,
0807 30.08.2002, 2.08.2007
NoI-0800, NoI-0701, NoI-0702, пос. Новоорловск (ЦП I) 24.08.2000, 21.07.2001, 8.07.2002,
NoI-0802 29.08.2002
NoII-0701, NoII-0702, NoII-0802 пос. Новоорловск (ЦП II) 22.07.2001, 8.07.2002, 29.08.2002
OI-0702, OI-0802 пос. Орловский (ЦП I) 7.07.2002, 30.08.2002
OII-0702 пос. Орловский (ЦП II) 7.07.2002
TsH-0701, TsH-0702 с. Цокто-Хангил 24.07.2001, 11.07.2002

Приморский край Kh-0604 Nd-0604 с. Хороль пос. Новодевица
3.07.2002 30.06.2004 Описание изученных местообитаний и структура ценопопуляций S. flavescens были представлены ранее [6].
Экстракция, фракционирование и выделение фенольных соединений S. flavescens. Подземная
часть (сырье №TsH-0702). Измельченное сырье (400 г) экстрагировали 70% EtOH (1 : 15) на кипящей водя-ной бане пятикратно. Спиртовое извлечение концентрировали до водного остатка, который подвергали жид-кофазной экстракции С6Н14, CHCl3, EtAc, в результате чего были получены гексановая (5,28 г; 1,32% от мас-сы возд.-сух. сырья), хлороформная (26,24 г; 6,56%), этилацетатная фракции (5,92 г, 1,48%) и водный остаток (117,68 г; 29,42%). Хлороформную (20 г) фракцию разделяли с применением КХ на SiO2 (3×40 см) в гради-ентной системе гексан-EtAc (100:0—>60:40) с последующей рехроматографией полученных фракций на Сефа-дексе LH-20 (2×50 см) в системе CHCl3 - EtOH (100 : 0 —> 85 : 15) и препаративной ТСХ (системы раствори-телей - 1, 2). Этилацетатную фракцию (5 г) хроматографировали на SiO2 (2×30 см) в градиентной системе CHCl3 - EtOH (100 : 0 —> 70 : 30) и далее на Сефадексе LH-20 (2×40 см) в системе CHCl3 - EtOH (100 : 0 —>
Кушенол
Изокураринон
Кураридин
Софорафлаванон
Кураринон
Изоксантогумол
Количественный анализ S. flavescens.
Суммарное содержание флавоноидов в ПЧ S. flavescens пе-ресчете на кураринон определяли по ранее разработанной методике [18], в НЧ и цветках - методом диффе-ренциальной спектрофотометрии пересчете на цинарозид (ДМ-2) и рутин [19] соответственно. Содержание кураринона и софорафлаванона G в ПЧ S. flavescens определяли ВЭТСХ-денситометрическим методом [20], содержание индивидуальных фенольных соединений в НЧ, кофейной и хлорогеновой кислот в ПЧ S. flavescens - методом ВЭЖХ [21].

Результаты и их обсуждение
В результате хроматографического разделения и идентификации в подземной части (ПЧ) S. flaves-cens установлено присутствие 11 соединений: кушенола А (1), изокураринона (2), кураридина (3), софо-рафлаванона G (4), кураринона (5), изоксантогумола (6), умбелиферона (7), скополетина (8), феруловой (9), кофейной (10) и хлорогеновой кислот (11). Из надземной части (НЧ) S. flavescens было выделено 10 соеди-нений: апигенин (1'), лютеолин (2'), кверцетин (3'), умбеллиферон (4'), цинарозид (6'), космосиин (7'), ру-тин (8'), кофейная (5'), хлорогеновая (9') и неохлорогеновая кислоты (10'). Хроматографический анализ (ВЭЖХ) показал, что в цветках S. flavescens присутствуют рутин и кофейная кислота, также обнаруженные в следовых количествах в семенах и створках. Впервые в составе фенольных соединений S. flavescens об-наружены: в ПЧ - 8-11, в НЧ - 1'-4', 8'-10'. Следует отметить, что в НЧ S. flavescens не было выявлено при-сутствие пренилированных флаванонов и халконов, характерных для ПЧ данного растительного сырья.
Согласно данным хроматографического анализа содержание кураринона и софорафлаванона G в ПЧ S. flavescens составляет 4,80 и 3,34 мг/г соответственно (табл. 2). Доминирующими компонентами НЧ яв-ляются цинарозид (2,22 мг/г) и рутин (1,13 мг/г).
Таблица 2. Содержание фенольных соединений в S. flavescens

Соединение Подземная часть Надземная часть
Кураринон, мг/г " 4,80±0,11 –
Софорафлаванон G, мг/г " 3,34±0,07 –
Лютеолин, мкг/г – 46,12
Апигенин, мкг/г – 51,94
Цинарозид, мкг/г – 2219,93
Космосиин, мкг/г – 493,80
Рутин, мкг/г – 1129,71
Кофейная кислота, мкг/г 56,29 33,74
Хлорогеновая кислота, мкг/г 230,77 462,31
Неохлорогеновая кислота, мкг/г – 205,68
Суммарное содержание флавоноидов, мг/г" 31,28±0,63 г 8,31±0,17d

Исследование компонентного состава флавоноидов ПЧ 12 российских популяций S. flavescens пока-зало, что в сырье, собранном в Забайкальском крае и АБАО, кураринон и софорафлаванон G являются до-минирующими. Для популяций S. flavescens из Приморского края наряду с указанными соединениями от-мечено повышенное кураридина. Суммарное содержание флавоноидов в ПЧ S. flavescens составляет 1,11-3,85% (рис. 1); наибольшая концентрация данного класса соединений установлена в популяциях АБАО Ага (2,44-3,85%) иНовоорловск (1,87-3,28%).
Изученные местообитания S. flavescens географически представляют три блока: читинские южные (Орловский, Новоорловский, Цокто-Хангил, Ага), читинские юго-восточные (Нерчинский Завод, Георги-евка, Запокровский) и приморские (Хороль, Новодевица). Сравнение полученных данных с данными воз-растной структуры и жизненностью ценопуляций выявило следующие особенности: наибольшее содержа-ние флавоноидов отмечено в зрелых ценопопуляциях, которые не тяготеют к молодым или старым попу-ляциям. В зрелых популяциях преобладают генеративные растения, которые характеризуются максимальным развитием корневищ. В целом следует отметить, что более засушливые местообитания способствуют большему накоплению флавоноидов
Сырье ПЧ S. flavescens, как правило, представляет собой смесь корневищ и корней, в связи с чем на-ми было проведено раздельное определение флавоноидов в этих двух морфологических группах и установлено, что качественный состав данных соединений не различается, однако в корневищах отмечено большее содержание флавоноидов, чем в корнях на 2.4-38,6% (рис. 2).
Определение места локализации флавоноидов в ПЧ S. flavescens показало, что для эпидермальных слоев характерно большее накопление, чем для сердцевины, в 3,6 (корень) - 11 раз (корневище) (табл. 3). Содержание кураринона и софорафлаванона G наибольшее в эпидермисе корневища (2,59 и 2,78% соот-ветственно), чем в эпидермисе корня (1,06 и 0,93% соответственно). Содержание кураринона и софорафла-ванона G в общей пробе корневища для сырья NzII-0602 составляет 0,50 и 0,36% соответственно, в общей пробе корня - 0,39 и 0,28% соответственно.

Содержание флавоноидов в ПЧ S. flavescens российских популяций. По оси абсцисс - номер образца сырья. Над столбцами указаны величины содержания флавоноидов, %

Содержание флавоноидов в корнях (1), корневищах (2) и общей пробе сырья S. flavescens. По оси абсцисс - номер образца сырья. Над столбцами указаны величины содержания флавоноидов, %

Содержание флавоноидов в ПЧ S. flavescens, %"
Образец Суммарное содержание флавоноидов Кураринон Софорафлаванон G
Корневище
Общая проба Эпидермис Сердцевина 2,47±0,05 11,63±0,23 1,06±0,02 0,504±0,011 2,594±0,052 0,210±0,004 0,355±0,007 2,781±0,061 0,117±0,002
Корень
Общая проба Эпидермис Сердцевина 2,44±0,05 4,59±0,10 1,29±0,02 0,388±0,007 1,064±0,023 0,046±0,001 0,283±0,006 0,930±0,024 0,063±0,001
" Образец сырья NzII-0602.
Исследование характера накопления флавоноидов в ПЧ S. Flavescens показало, что для ювенильных растений характерно наибольшее содержание (3,28%), которое постепенно снижается в процессе вегетации до 1,42% у растений в генеративном старом возрастном состоянии (табл. 4).
Известно, что процентное соотношение массы эпидермиса к сердцевине выше у молодых растений, что обусловливает подобную динамику накопления флавоноидов. Для органов НЧ максимальное содержа-ние флавоноидов отмечается в генеративном молодом возрастном состоянии - 0,74% у листьев и 0,18% у стеблей, и в генеративном старом возрастном состоянии для цветков (0,85%).

Суммарное содержание флавоноидов в S. flavescens в процессе вегетации, %
Возрастное состояние (лет) Листья " Стебли Цветки6 Корни и корневища"
j (1–5) 0,183±0,004г – 3,28±0,06
im (2–12) 0,452±0,009 0,087±0,002 – 2,78±0,05
v (6–22) 0,443±0,009 0,124±0,002 – 2,25±0,04
g1 (13–34) 0,741±0,014 0,183±0,004 0,344±0,007 2,14±0,04
g2 (23–49) 0,334±0,008 0,140±0,003 0,415±0,008 1,60±0,03
g3 (30-64) 0,310±0,007 0,091±0,002 0,848±0,016 1,42±0,03

Список литературы
1. Олейников Д.Н., Санданов Д.В. Фенольные соединения Sophora flavescens (Fabaceae). Компонентный состав и биологическая активность (обзор литературы) // Растительные ресурсы. 2010. Т. 46, №2. С. 126-159.
2. Ueno A., Hirakawa K., Fukushima S., Noro T., Morinaga K. Studies on constituents of Sophora flavescens Aiton // Chem. Pharm. Bull. 1978. Vol. 26, N8. Pp. 2407-2410.
3. Schwarte A. Phytochemische und pharmakologische Untersuchungen der Wurzeln von Sophora flavescens, unter besonde-rer Berücksichtigung ihrer Wirkung auf die Leukotrien- und Prostaglandinbiosynthese. Dissertation Dokt. Math.-Naturwis. Fakult. Düsseldorf, 2002.
4. Olennikov D.N., Tankhaeva L.M., Sandanov D.V. Carbohydrates from Sophora flavescens seeds // Chem. Nat. Compd. 2007. Vol. 43, N5. Pp. 603-604.
5. Olennikov D.N., Stolbikova A.V., Rokhin A.V., Khobrakova V.B., Tankhaeva L.M. Polysaccharides of Fabaceae. V. a-Glucan from Sophora flavescens roots // Chem. Nat. Comp. 2011. Vol. 47, N1. Pp. 1-4.
6. Sandanov D.V. Vitality of individuals and cenopopulations of Sophora flavescens Soland. // Contemp. Probl. Ecol. 2009. Vol. 2, N6. Pp. 576-580.
7. Olennikov D.N., Tankhaeva L.M. Biologically active substances from Cacalia hastata L. 5. Triperpenes and coumarines // Chem. Nat. Compd. 2005. Vol. 41, N5. Pp. 600-601.
8. Kurkin V.A. Phenylpropanoids from medicinal plants: Distribution, classification, structural analysis, and biological activity // Chem. Nat. Compd. 2003. Vol. 39, N2. Pp. 123-153.
9. Olennikov D.N., Tankhaeva L.M., Nikolaeva G.G., Nikolaev S.M. Biologically active substances from Cacalia hastata L. 4. Phenolic acids // Chem. Nat. Compd. 2005. Vol. 41, N2. Pp. 222-223.
10. Olennikov D.N., Tankhaeva L.M., Stolbikova A.V., Petrov A.V. Phenylpropanoids and polysaccharides of Plantago de-pressa and P. media from Buryatia // Chem. Nat. Compd. 2011. Vol. 47, N2. Pp. 153-157.
11. Malikov V.M., Yuldashev M.P. Phenolic compounds of plants of the Scutellaria L. genus. Distribution, structure, and properties // Chem. Nat. Compd. 2002. Vol. 38, N4. Pp. 358–406.
12. Olennikov D.N., Chirikova N.K., Tankhaeva L.M. Chemical investigation of Lophanthus chinensis // Chem. Nat. Compd. 2010. Vol. 46, N2. Pp. 301-302.
13. Wu L.J., Miyase T., Ueno A., Kuroyanagi M., Noro T., Fukushima S. Studies on constituents of Sophora flavescens Aiton. II. // Chem. Pharm. Bull. 1985. Vol. 33, N8. Pp. 3231-3236.
14. Kyogoky K., Hatayama K., Komatsu M. Constituents of Chinese crude drug «Kushen» (the roots Sophora flavescens Ait.). Isolation of five new flavonoids and formononetin // Chem. Pharm. Bull. 1973. Vol. 21, N12. Pp. 2733-2738.
15. Iinuma M., Tanaka T., Mizuno M., Shirataki Y., Yokoe I., Komatsu M., Lang F.A. Two flavanones in Sophora leachiano and some related structures // Phytochemistry. Vol. 29, N8. Pp. 2667-2669.
16. Jung H.A., Jeong D.-M., Chung H.U., Lim H.A., Kim J.Y., Yoon N.Y., Choi J.S. Re-evaluation of the antioxidant prenylated flavonoids from the roots of Sophora flavescens // Biol. Pharm. Bull. 2008. Vol. 31, N5. Pp. 908-915.
17. Ren Z.-Y., Qi H.-Y., Shi Y.-P. Phytochemical investigation of Anaphalis lactea // Planta Med. 2008. Vol. 74, N8. Pp. 859-863.
18. Олейников Д.Н., Санданов Д.В. Методика количественного определения суммарного содержания фенольных соеди-нений в подземных органах Sophora flavescens (Fabaceae) // Растительные ресурсы. 2010. Т. 46, №3. С. 126-133.
19. Ломбоева С.С, Танхаева Л.М., Олейников Д.Н. Методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части ортилии однобокой // Химия растительного сырья. 2008. №2. С. 65-68.
20. Olennikov D.N. Densitometric HPTLC analysis of kurarinone and sophoraflavanone G in Sophora flavescens root // J. Planar Chrom. - Modern TLC. 2011. Vol. 24, N2. Pp. 121-124.
21. Olennikov D.N., Tankhaeva L.M. Phenolic compounds form Rhododendron dauricum from Baikal region // Chem. Nat. Compd. 2010. Vol. 46, N3. Pp. 471–473.

Olennikov D.N.1*, Tankhaeva L.M.1, Pankrushina N.A.2, Sandanov D.V.1 PHENOLIC COMPOUNDS OF SOPHORA FLAVESCENS SOLAND. OF RUSSIAN ORIGIN
It was established the qualitative composition and quantitative content of phenolic compounds of underground and aboveground parts of Sophora flavescens Soland. (Fabaceae family) growing in Russia (Transbaikalia, Primorsky Krai, Aga Buryat Autonomous District). From the roots with rhizomes 11 compounds were isolated including kushenol A, isokurarinon, kuraridin, sophoraflavanon G, kurarinon, isoxanthohumol, umbeliferon, and for the first time – scopoletin, ferulic, caffeic and chlorogenic acids. In S. flavescens herb 10 phenolic compounds were identified namely cynaroside, cosmosiin, caffeic acid, and the first time – apigenin, luteolin, quercetin, umbelliferone, rutin, chlorogenic and neochlorogenic acids. Dominant compounds of underground organs were kurarinon and sophoraflavanon G, and in above-ground part were cynaroside and rutin. Investigation of the location place of flavonoids in underground part of S. flavescens was showed that the maximum content observed in the epidermal layers of rhizomes. The dynamics of flavonoids accumulation in S. flavescens was investigated.
Keywords: Sophora flavescens Soland., Fabaceae, flavonoids, cenopopulations, dynamics of accumulation, HPTLC, HPLC.

References
1. Olennikov D.N., Sandanov D.V. Rastitel'nye resursy, 2010, vol. 46, no. 2, pp. 126–159 (in Russ.).
2. Ueno A., Hirakawa K., Fukushima S., Noro T., Morinaga K. Chem. Pharm. Bull., 1978, vol. 26, no. 8, pp. 2407–2410.
3. Schwarte A. Phytochemische und pharmakologische Untersuchungen der Wurzeln von Sophora flavescens, unter besonde-rer Berücksichtigung ihrer Wirkung auf die Leukotrien- und Prostaglandinbiosynthese. Dissertation Dokt. Math.-Naturwis. Fakult. Düsseldorf, 2002.
4. Olennikov D.N., Tankhaeva L.M., Sandanov D.V. Chem. Nat. Compd., 2007, vol. 43, no. 5, pp. 603–604.
5. Olennikov D.N., Stolbikova A.V., Rokhin A.V., Khobrakova V.B., Tankhaeva L.M. Chem. Nat. Compd, 2011, vol. 47, no. 1, pp. 1–4.
6. Sandanov D.V. Contemp. Probl. Ecol., 2009, vol. 2, no. 6, pp. 576–580.
7. Olennikov D.N., Tankhaeva L.M. Chem. Nat. Compd., 2005, vol. 41, no. 5, pp. 600–601.
8. Kurkin V.A. Chem. Nat. Compd., 2003, vol. 39, no. 2, pp. 123–153.
9. Olennikov D.N., Tankhaeva L.M., Nikolaeva G.G., Nikolaev S.M. Chem. Nat. Compd., 2005, vol. 41, no. 2, pp. 222–223.
10. Olennikov D.N., Tankhaeva L.M., Stolbikova A.V., Petrov A.V. Chem. Nat. Compd., 2011, vol. 47, no. 2, pp. 153–157.
11. Malikov V.M., Yuldashev M.P. Chem. Nat. Compd., 2002, vol. 38, no. 4, pp. 358–406.
12. Olennikov D.N., Chirikova N.K., Tankhaeva L.M. Chem. Nat. Compd., 2010, vol. 46, no. 2, pp. 301–302.
13. Wu L.J., Miyase T., Ueno A., Kuroyanagi M., Noro T., Fukushima S. Chem. Pharm. Bull., 1985, vol. 33, no. 8, pp. 3231–3236.
14. Kyogoky K., Hatayama K., Komatsu M. Chem. Pharm. Bull., 1973, vol. 21, no. 12, pp. 2733–2738.
15. Iinuma M., Tanaka T., Mizuno M., Shirataki Y., Yokoe I., Komatsu M., Lang F.A. Phytochemistry, vol. 29, no. 8, pp. 2667–2669.
16. Jung H.A., Jeong D.-M., Chung H.U., Lim H.A., Kim J.Y., Yoon N.Y., Choi J.S. Biol. Pharm. Bull., 2008, vol. 31, no. 5, pp. 908–915.
17. Ren Z.-Y., Qi H.-Y., Shi Y.-P. Planta Med., 2008, vol. 74, no. 8, pp. 859–863.
18. Olennikov D.N., Sandanov D.V. Rastitel'nye resursy, 2010, vol. 46, no. 3, pp. 126–133 (in Russ.).
19. Lomboeva S.S., Tankhaeva L.M., Olennikov D.N. Khimiia rastitel'nogo syr'ia, 2008, no. 2, pp. 65–68 (in Russ.).
20. Olennikov D.N. J. Planar Chrom. – Modern TLC, 2011, vol. 24, no. 2, pp. 121–124.
21. Olennikov D.N., Tankhaeva L.M. Chem. Nat. Compd., 2010, vol. 46, no. 3, pp. 471–473.