Исследован процесс экстракции полисахаридов корней одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg., сем.Asteraceae) и найдены оптимальные параметры извлечения полифруктанов. Разработана методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в пересчете на фруктозу с относительной ошибкой не более 2%. Установлено, что содержание полифруктанов в корнях T. officinale коммерческих образцов сырья составляет 15–33%.
Сокращения: СП – степень полимеризации, Frc –фруктоза, Glc – глюкоза, Kes – 1-кестоза, M – молекулярная масса, Nys – нистоза, Sac – сахароза.
Введение
Одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale Wigg., сем. Asteraceae) – растение, включенное в большинство мировых фармакопей. Химический состав данного растительного вида разнообразен; в T. officinale обнаружены углеводы, флавоноиды, фенольные кислоты, терпеновые соединения и др., комплекс которых обусловливает его биологическую активность [1].
Фруктаны корней Taraxacum officinale являются предметом многочисленных научных исследований; к настоящему времени известно о присутствии низко- и высокомолекулярных производных 1-кесто-n-озы (n = 3–10) и инуло-n-озы (n = 2–5) [2–6]. Фармакологические эксперименты показали, что суммарные полисахаридные фракции корней T. officinale обладают сахароснижающим [7], диуретическим [8], бифидогенным [9] и противоопухолевым действием [10].
Качество сырья «Корни одуванчика» в России регламентируется фармакопеей, которая не предлагает методик количественной оценки содержания полисахаридов (полифруктанов) [11], поэтому целью настоящей работы является определение оптимальных параметров экстракции полифруктанов из корней T. officinale, разработка методики количественного определения суммарного содержания полифруктанов и ее метрологический анализ.
Экспериментальные условия
Корни T. officinale приобретены через аптечную сеть. В работе использованы стандартные образцы веществ: фруктоза, глюкоза, сахароза, инулин (Acros Organics), 1-кестоза, нистоза (Carbosynth Lim.);
ВЭТСХ проводили на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-В (Сорбполимер); спектроскопические исследования – на спектрофотометре CE 2011 (Cecil) в кварцевых кюветах 10 мм. Оптическое вращение ([α]D) определяли на поляриметре СМ-3 (Загорский оптико-механический завод), в кювете длиной 1 дм при 20 °С. ИК-спектры регистрировали на ИК-Фурье спектрометре Spectrum 100 (Perkin-Elmer) в пленке на пластинах КРС-5 в интервале 4000–450 см–1. Гель-хроматографию проводили на Сефадексе G-75 (Pharmacia) [12].
Условия гидролиза, экстракции, ВЭТСХ и выделения водорастворимых полисахаридов корней T. officinale (ToPs) описаны ранее [13]. Из 50 г сырья получено 8,52 г ToPs.
Методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в корнях T. officinale в пересчете на фруктозу. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, приливают 100 мл 95% спирта этилового, присоединяют обратный холодильник и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. После охлаждения извлечение фильтруют. Экстракцию сырья повторяют в тех же условиях еще 2 раза со 100 и 50 мл экстрагента.
К обработанному сырью приливают 100 мл воды очищенной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. Извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию сырья повторяют еще 2 раза со 100 и 50 мл воды очищенной в течение 60 и 45 мин соответственно. Объем объединенного фильтрата доводят водой очищенной до метки (раствор А). 1 мл раствора А переносят в пробирку вместимостью 25 мл, приливают 1 мл 0,01% раствора тиомочевины, 1 мл 1% раствора резорцина, 8 мл 95% спирта этилового, 9 мл кислоты хлористоводородной концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 8 мин. После охлаждения реакционную смесь переносят в мерную колбу вместимостью 200 мл и доводят объем раствора до метки водой очищенной (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б определяют при длине волны 480 нм.
Для приготовления раствора сравнения 1 мл раствора А переносят в пробирку вместимостью 25 мл, приливают 1 мл 0,01% раствора тиомочевины, 9 мл 95% спирта этилового, 9 мл кислоты хлористоводородной концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 8 мин. После охлаждения реакционную смесь переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки водой очищенной.
Приготовление раствора стандартного образца фруктозы. Около 0,080 г (точная навеска) фруктозы переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде очищенной и доводят объем раствора до метки тем же растворителем (раствор А). 1 мл раствора А переносят в пробирку вместимостью 25 мл, приливают 1 мл 0,01% раствора тиомочевины, 1 мл 1% раствора резорцина, 8 мл 95% спирта этилового, 9 мл кислоты хлористоводородной концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 8 мин. После охлаждения реакционную смесь переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки водой очищенной (раствор Б).
Регрессионный анализ проводили с применением пакета программ Advanced Grapher ver. 2.11 (Alentum Software Inc.), метрологический анализ и обработку результатов – согласно рекомендациям [14].
Результаты и их обсуждение
Суммарный комплекс полисахаридов корней T. officinale – ToPs (выход 17,04% от массы сырья), представляет собой неокрашенное аморфное вещество, хорошо растворимое в воде при нагревании, растворы которого обладают оптической активностью {[α]D -43° (c 2.0, Н2О)}. ToPs содержит 87,94±2,19% углеводов; после гидролиза обнаружены фруктоза и следы глюкозы, а спектр поглощения окрашенного комплекса ToPs с резорцином совпадает с таковым инулина.
В ИК-спектре выявлены полосы поглощения, характерные для фруктанов типа инулина (ν: 1427, 1332, 1250, 1245, 1134, 1087, 1071, 1031, 915, 874, 852, 817 см–1). Гель-хроматография показала, что ToPs гетерогенен и содержит ряд полимеров с М 2,0–7,0 кДа (рис. 2). Полученные данные подтверждают результаты ранних исследований и позволяют отнести полисахариды корней T. officinale к фруктанам.
Фруктозосодержащие соединения также обнаружены в составе свободных углеводов корней T. officinale: хроматографически (ВЭТСХ) выявлено присутствие фруктозы, сахарозы, 1-кестозы и нистозы, а также ряда олигомеров с более высокой СП (рис. 3). Данный факт свидетельствует о невозможности прямого определения полимерных фруктанов из водного извлечения без предварительной обработки сырья, способствующей удалению низкомолекулярных углеводов; также исключается использование спиртового осаждения полисахаридов вследствие неудовлетворительных преципитационных характеристик фруктанов [15].
Поэтому в ходе разработки методики определения полисахаридов в корнях T. officinale на начальном этапе необходимо было подобрать оптимальные условия для удаления моно- и олигосахаридов из сырья.
Для решения данной задачи были применены подходы, предложенные ранее для двух видов фруктан содержащего сырья – корневищ и корней девясила [16] и корней лопуха [13]. Установлено, что для более полного удаления свободных углеводов необходимо проведение 3-кратной экстракции 95% спиртом этиловым при 100 °С в течение 60 мин каждая и соотношение сырье : экстрагент 1 : 100. Применение данных условий позволяет добиться 98% экстракции свободных углеводов из сырья.
Анализируя хроматографические данные, следует отметить, что скорость экстракции фруктозы и 1-кестозы наибольшая, а нистоза и более высокомолекулярные олигомеры могут присутствовать в извлечениях 4-й кратности. Общее содержание свободных углеводов в пересчете на фруктозу в корнях T. officinale составляет 13,16–17,95% от массы сырья.
Приведены результаты выбора оптимальных условий экстракции фруктанов из корней T. officinale.
Определено, что оптимальными параметрами экстракции полифруктанов являются степень измельчения сырья 0,5–1,0 мм, температура экстракции 100 °С, трехкратная экстракция длительностью 60 мин каждая при соотношении сырье : экстрагент 1 : 100 (1 и 2 контакты фаз) и 1 : 50 (3 контакт фаз).
С применением метода «введено-найдено» выявлено, что относительная ошибка определения не превышает 2% и может быть положительной и отрицательной.
В ходе определения метрологических характеристик разработанной методики установлено, что относительная ошибка не превышает 2%.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанная методика является правильной и воспроизводимой и может быть рекомендована в практике фармацевтического анализа для количественной характеристики корней T. officinale.
Выводы
В ходе исследования официнального растительного сырья – корней одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.) определены оптимальные параметры экстракции полисахаридов (полифруктанов).
Разработана методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов, основанная на резорциновом методе определения кетоз, с величиной относительной ошибки не более 2%.
Список литературы
1. Schültz K., Carle R., Schieber A. Taraxacum – A review on its phytochemical and pharmacological profile // J. Ethnopharmacol.2006. V. 107. Pp. 313–323.
2. Yanovsky E., Kingsbury R.M. New sources of inulin // J. Am. Chem. Soc. 1931. V. 53. Pp. 1597–1601.
3. Bacon J.S.D., Edelman J. The carbohydrates of the Jerusalem artichoke and other Compositae // Biochem. J. 1951.V. 48. Pp. 114–126.
4. Rutherford P.P., Deacon A.C. The mode of action of dandelion root β-fructofuranosidases on inulin // Biochem. J.1972. V. 129. Pp. 511–512.
5. Rutherford P.P., Deacon A.C. Seasonal variation of dandelion roots of fructosan composition // Ann. Bot. 1974. V. 38.Pp. 251–260.
6. Ernst M., Chatterton N.J., Harrison P.A. Purification and characterization of a new fructan series from species of Asteraceae// New Phytol. 1996. V. 132. Pp. 63–66.
7. Akhtar M.S., Khan Q.M., Khalid T. Effect of Portulaca olearaceae (Kulfa) and Taraxacum officinale (Dhudhai) in nornoglycaemic and alloxan-treated hyperglycaemic rabbits // J. Pak. Med. Assoc. 1985. V. 35. Pp. 207–210.
8. Taraxacum officinale. Monograph // Altern. Med. Rev. 1999. V. 4. Pp. 112–114.
9. Trojanová I., Rada V., Kokoška L., Vlková E. The bifidogenic effect of Taraxacum officinale root // Fitoterapia. 2004.V. 75. Pp. 760–763.
10. Baba K., Abe S., Mizuno D. Antitumor activity of hot water extract of dandelion, Taraxacum officinale – Correlation between antitumor activity and timing of administration // Yakkugaku Zasshi. 1981. V. 101. Pp. 538–543.
11. Государственная фармакопея СССР. XI изд. М., 1990. Вып. 2. С. 356–357.
12. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Углеводы Lamiaceae. I. Пектиновые вещества и гемицеллюлозы Mentha x piperita // Химия природных соединений. 2007. №5. С. 411–416.
13. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в корнях лопуха (Arctium spp.) // Химия растительного сырья. 2010. №1. С. 115–120.
14. Дёрффель К. Статистика в аналитической химии. М., 1994. 252 с.
15. Ku Y., Jansen O., Oles C.J., Lazar E.Z., Rader J.I. Precipitation of inulins and oligoglucosides by ethanol and other solvents // Food Chem. 2003. V. 81. Pp. 125–132.
16. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М., Чехирова Г.В., Петров Е.В. Методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в корневищах и корнях девясила высокого (Inula helenium L.) // Химия растительного сырья. 2008. №1. С. 95–99.