ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛАВОНОИДНОГО СОСТАВА ЦВЕТКОВ ПИЖМЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (TANACETUM VULGARE L.) А.В. Куркина Самарский государственный медицинский университет, ул. Чапаевская, 89, Самара (Россия)

Из цветков пижмы обыкновенной (Tanacetum vulgare L.) с использованием колоночной хроматографии выделены 7-0-Р-D-глюкопиранозид акацетина (тилианин), 7-О-Р-О-глюкопиранозид апигенина (космосиин), акацетин (5,7-дигидрокси-41-метококсифлавон) и апигенин (5,7,41-тригидроксифлавон). Идентификация выделенных флавоноидов осуществлена на основании данных 1Н-ЯМР-, УФ-спектроскопии, масс-спектрометрии, тонкослойной хроматографии и результатов различных химических превращений.

Тилианин (доминирующий флавоноид) и космосиин впервые выделены из цветков исследуемого растения.

Введение
Цветки пижмы обыкновенной (Tanacetum vulgare L.) в виде различных лекарственных форм широко применяются в качестве противоглистных и желчегонных средств [1-4]. Фармакологические свойства пре-паратов цветков пижмы в основном обусловлены эфирным маслом (туйон и другие терпеноиды) и флавоноидами. По разным литературным источникам [2-4], флавоноиды цветков пижмы обыкновенной в основном представлены апигенином (5,7,41-тригидроксифлавон), акацетином (5,7-дигидрокси-41-метоксифлавон), лютеолином (5,7,31,4^тетрагидроксифлавон), цинарозидом (7-0-р-D-глюкопиранозид 5,7,31,4^тетрагидроксифлавона), эупатилином (5,7- дигидрокси-6,31,41-триметоксифлавон), яцеидином (5,7,41-тригидрокси-3,6,3^триметоксифлавон), яцеозидином (5,7,41-тригидрокси-6,31-диметоксифлавон), однако приведенные в отечественной и зарубежной литературе данные довольно противоречивы, особенно относительно того, какой флавоноид является доминирующим компонентом.

Этот вопрос актуален в той связи, что проблемы химической стандартизации сырья и препаратов данного растения решены не в полной мере. В соответствии с Государственной фармакопеей СССР XI издания (ст. 11) количественное определение суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот осуществляют методом прямой спектрофотометрии буферного раствора упаренного спиртового извлечения цветков пижмы обыкновенной при длине волны 310 нм [5]. Обсуждаемая методика количественного определения достаточно длительна, трудоемка и требует работы с токсичным растворителем (дихлорэтан), а выбранная аналитическая длина волны не соответствует спектральным характеристикам анализируемых веществ. Кроме того, в данной фармакопейной статье отсутствует раздел «Качественные реакции», что не соответствует современным тенденциям в области фармацевтического анализа лекарственного растительного сырья [2].

На наш взгляд, несмотря на сложный химический состав цветков пижмы обыкновенной, представленный такими группами биологически активных соединений (БАС), как эфирное масло, флавоноиды, гидроксикоричные кислоты, стандартизацию сырья данного растения целесообразно осуществлять по флавоноидам. Именно флавоноиды в первую очередь обусловливают желчегонные и гепатопротекторные свойства препаратов пижмы обыкновенной. Ранее нами разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в цветках пижмы [6], однако с учетом перспективы использования для целей стандартизации цветков пижмы обыкновенной, представляющего собой сумму флавоноидов [7], высокоэффективной жидкостной хроматографии необходимым является исследование компонентного состава флавоноидов цветков пижмы обыкновенной.

Цель настоящей работы - исследование флавоноидного состава цветков пижмы обыкновенной, произрастающей в Самарской области (Россия).

Экспериментальная часть
Исследовали цветки пижмы обыкновенной, собранные в окрестностях села Нижнее Санчелеево Самарской области (июль 2008 г.). Цветки пижмы обыкновенной (150 г) подвергали исчерпывающему экстрагированию 70% этиловым спиртом, сочетая при этом способ мацерации (24 ч) с последующей термической экстракцией при температуре 85-90 °С. Водноспиртовые экстракты упаривали под вакуумом до густого остатка (около 50 мл). Сгущенный экстракт высушивали на силикагеле L 40/100, полученный порошок (экстракт+силикагель) наносили на слой силикагеля, сформированный в хлороформе. Хроматографическую колонку элюировали хлороформом и смесью хлороформ-этанол в различных соотношениях (97 : 3; 95 : 5; 93 : 7; 90 : 10; 88 : 12; 85 : 15; 80 : 20; 70 : 30). Контроль за разделением веществ осуществляли с помощью ТСХ-анализа на пластинках «Silufol UV 254» и «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системах хлороформ - этанол (4 : 1), а также хлороформ - этанол - вода (26 : 16 : 3).

Фракции, содержащие доминирующее вещество 1, были объединены, выпавший из них осадок был отделен и перекристиллизован из спирта этилового. При этом получен флавоноид 1 с выходом 0,2% от массы воздушносухого сырья. Фракции, содержащие соединения 2-4 (каждый отдельно), наносили на полиамид «Wolem» с целью дальнейшей очистки. Сухой порошок (экстракт+полиамид) переносили в хроматографическую колонку (высота сорбента - 4,0 см, диаметр - 5 см). Соответствующую хроматографическую колонку элюировали водой и водным раствором этилового спирта (20; 40; 70; 96%). В результате проведенной очистки на колонках с полиамидом были получены вещество 2 (элюент - 96% этиловый спирт), вещество 3 (элюент - 40% этиловый спирт) и вещество 4 (элюент - 70% этиловый спирт), дополнительную очистку которых удалось провести путем перекристаллизации из водного спирта.
Спектры ЯМР 1Н получали на приборах «Bruker AM 300» (300 МГц) и «Gemini-200» (200 МГц), массспектры снимали на массспектрометре «Kratos MS-30», регистрацию УФ-спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena).

Соединение 1. 7-0-р-D-глюкопиранозид акацетина (тилианин), кристаллы белого цвета, С22Н22О10, М+ агликона 284 (100 %), т.пл. 236-239 °С (водный спирт). УФ-спектр (EtOH, Xmax, нм): 270, 327; +NaoAc, 270, 327; +NaoMe, 290, 367; +AlCl3, 279, 300, 336, 382; +AlCl3+HCl 279, 300, 336, 382, Cпектр ЯМР 1Н (300 МГц, ДМСО-d6, 5, м.д., J/Гц): 3,2-3,8 (6Н глюкозы), 3,87 (с, 3Н, ОСН3), 5,35 (Ш, д, J = 7,2, Н-111 глюкопиранозы), 6,45 (Ш, д, J = 2,5, Н-6), 6,84 (1H, д, J = 2,5, Н-8), 6,95 (1H, c, Н-3), 7,14 (2H, д, J =9, Н-31 и Н-51 - 2Н), 8,07 (2Н, д, J = 9, Н-21 и Н-61), 12,92 (1H, c, 5-ОН группы).

Соединение 2. 5,7-дигидрокси-41-метококсифлавон (акацетин), кристаллы светло-желтого цвета состава C16H12O5, т.пл. 264-267 °С (водный спирт). УФ-спектр (EtOH, Xmax, нм): 270, 328; +NaoAc, 275, 350 пл.; +NaoMe, 278, 374; +AlCl3, 279, 300, 337, 382; +AlCl3+HCl 279, 300, 337, 382, Cпектр ЯМР 1Н (200 МГц, ДМСО-d6, 5, м.д., J/Гц): 3,86 (с, 3Н, ОСН3), 6,43 (Ш, д, J = 2, Н-6), 6,80 (д, J =2,5, Н-8), 6,96 (1H, c, Н-3), 7,16 (2H, д, J =9, Н-31 и Н-51 - 2Н), 8,08 (2Н, д, J = 9, Н-21 и Н-61), 12,90 (1H, c, 5-ОН группы). Масс-спектр (70 eV, 200 °С, m/z, %): 284 (М+, 100).

Соединение 3. 7-0-(3-0-глюкопиранозид апигенина (космосиин), кристаллы светло-желтого цвета, С21Н20О10, М+ агликона 270 (100%), т.пл. 225-227 °С (водный спирт). УФ-спектр (EtOH, Xmax, нм): 270, 334; +NaoAc, 269, 378; +NaoMe, 278, 397; +AlCl3, 279, 330, 347, 384; +AlCl3+HCl 279, 330, 347, 384, Cпектр ЯМР 1Н (200 МГц, (CD3)2CO, 5, м.д., J/Гц): 3,3-4,0 (6Н глюкозы), 5,16 (Ш, д, J = 7,2, Н-111 глюкопиранозы), 6,44 (Ш, д, J = 2,5, Н-6), 6,82 (1H, д, J = 2,5, Н-8), 6,90 (1H, c, Н-3), 7,03 (2H, д, J =9, Н-31 и Н-51 - 2Н), 7,96 (2Н, д, J = 9, Н-21 и Н-61), 12,52 (1H, c, 5-ОН группы).

Соединение 4. 5,7,41-тригидроксифлавон (апигенин), кристаллы светло-желтого цвета, С15Н10О5, M, т.пл. 340-343 °С (водный спирт). УФ-спектр (EtOH, Xmax, нм): 270, 335; +NaoAc, 276, 378; +NaoMe, 278, 397; +AlCl3, 279, 330, 348, 385; +AlCl3+HCl 279, 330, 348, 385, Cпектр ЯМР 1Н (200 МГц, (CD3)2CO, 5, м.д., J/Гц): 6,43 (Ш, д, J = 2,5, Н-6), 6,81 (1H, д, J = 2,5, Н-8), 6,89 (1H, c, Н-3), 7,02 (2H, д, J =9, Н-31 и Н-51 - 2Н), 7,95 (2Н, д, J = 9, Н-21 и Н-61), 12,50 (1H, c, 5-ОН группы). Масс-спектр (70 eV, 200 °С, m/z, %): 270 (М+, 100).

Обсуждение результатов
Для установления химической структуры флавоноидов 1–4 нами использованы методы 1Н-ЯМР-, УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии, а также результаты химических превращений. Флавоноиды 1 и 3 расщепляются под воздействием кислотного гидролиза (10% HCl, 100 °С, 2 ч) и (3-глюкозидазы («Fluka», Венгрия) на глюкозу и агликоны, идентифицированные методом ТСХ с акацетином (5,7-дигидрокси-41-метококсифлавон) (2) и апигенином (5,7,41-тригидроксифлавон) (4) соответственно. Флавоноиды 2 и 4 выделены также из сырья пижмы в свободном виде. В спектре 1Н-ЯМР соединения 1 при 8,07 м.д. и 7,14 м.д. присутствуют два двухпротонных дублетных сигнала с константой спин-спинового взаимодействия (J) 9 Гц, отнесенные соответственно к протонам Н-21, 61 и Н-31, 51, два однопротонных дублетных сигнала при 6,84 м.д. и 6,45 м.д. с J = 2,5 Гц, характерные для протонов кольца А флавоноида (Н-8 и Н-6), а также синглетный сигнал протона Н-3 при 6,95 м.д. (флавоновая природа вещества). При 3,87 м.д. обнаружен трехпротонный синглетный сигнал, принадлежащий ОСН3-группе при С-41. Кроме того, в спектре ЯМР обнаружен и синглетный сигнал 5-ОН группы флавоноида, что позволило в совокупности с результатами ферментативного гидролиза и данных УФ-спектроскопии (отсутствие батохромного сдвига коротковолновой полосы поглощения в присутствии ацетата натрия) отнести углеводный фрагмент к 7-ОН группе [8], причем глюкоза присоединена в виде (З-D-глюкопиранозильного остатка (характерный дублетный сигнал аномерного протона при 5,35 м.д. с J = 7,2 Гц).

Совокупность результатов химических исследований и спектральных данных позволяет предложить для соединения 1 следующее строение: 7-0-(3-0-глюкопиранозид 5,7-дигидрокси-41-метококсифлавона (тилианин) [9].

Аналогичным образом изучена и химическая структура соединения 3, которое на основании данных УФ-, ЯМР- и масс-спектров, а также результатов химический превращений идентифицировано как 7-О-р-D-глюкопиранозид 5,7,41-тригидроксифлавона (космосиин).

Следует отметить, что соединения 1 и 3 впервые выделены из цветков пижмы обыкновенной, причем тилианин (1) является доминирующим флавоноидом данного сырья (см. приложение к статье), что представляет интерес с точки зрения стандартизации, особенно в плане перспективы использования в методиках анализа ВЭЖХ, принимая во внимание то обстоятельство, что на основе суммы флавоноидов в Российской Федерации производится гепатопротекторный и желчегонный препарат «Танацехол» [1, 3, 4].

Результаты ТСХ-анализа свидетельствуют о том, что наряду с флавоноидами 1-4 на хроматограмме извлечения обнаруживаются еще два компонента: соединение 5 (величина Rf около 0,8), выделенное с помощью колоночной хроматографии, и соединение 6 (величина Rf около 0,15), полученное методом препаративной ТСХ. По предварительным данным, соединения 5 и 6 отнесены нами к фенилпропаноидам по характеру флуоресценции и характерным максимумам поглощения в УФ-спектрах (см. приложение к статье). При этом следует отметить, что соединение 6, являясь по характеру кривой поглощения производным кофейной кислоты [10], в значительной мере определяет кривую поглощения раствора водно-спиртового извлечения из цветков пижмы обыкновенной (см. приложение к статье). Что касается доминирующего флавоноида - тилианина (1), то и это соединение, имея максимумы поглощения при 270 и 327 нм, также вносит вклад в оптическую плотность, особенно с точки зрения определения суммы флавоноидов с использованием разработанной нами ранее методики количественного определения суммы флавоноидов [7].

Выводы
Из цветков пижмы обыкновенной (Tanacetum vulgare L.) выделены и идентифицированы 7-0-P-D-глюкопиранозид акацетина (тилианин), 7-0-(3-0-глюкопиранозид апигенина (космосиин), акацетин (5,7-дигидрокси-41-метококсифлавон) и апигенин (5,7,41-тригидроксифлавон).

Установлено, что тилианин является доминирующим флавоноидом цветков пижмы обыкновенной, причем наряду с космосиином этот компонент впервые выделен из цветков исследуемого растения.

Список литературы
1. Государственный реестр лекарственных средств. Официальное издание, М., 2008. Т. 1. 1238 с.
2. Куркин В.А. Фармакогнозия : учебник для фармацевтических вузов (факультетов). 2-е изд., перераб. и доп. Самара, 2007. 1239 с.
3. Куркин В.А. Основы фитотерапии : учебное пособие для студентов фармацевтических вузов. Самара, 2009. 963 с.
4. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейство Asteraceae (Compositae). СПб., 1993. С. 190-192.
5. Государственная фармакопея СССР. Одиннадцатое издание. М., 1990. Вып. 2. 400 с.
6. Куркина А.В., Хусаинова А.И. Методика определения суммы флавоноидов в цветках пижмы // Фармация. 2010. Т. 58, №3. С. 21-24.
7. ФС 42-3116-95. Танацехол. М., 1995. 6 с.
8. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B. The Systematic Identification of Flavonoids. Berlin-Heidelberg-New York: Springer Verlag, 1970. 354 p.
9. Захарова О.И., Захаров A.M., Глызин В.И. Флавоноиды Agastache rugosa // Химия природных соединений. 1979. №5. С. 642-646.
10. Куркин В.А., Авдеева Е.В. Проблемы стандартизации растительного сырья и препаратов, содержащих фенилпропаноиды // Фармация. 2009. Т. 57, №1. С. 51-54.