ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО (SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI) Н.К. Чирикова, Д.Н. Оленников, Л.М. Танхаева Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ (Россия)

Для количественного анализа флавоноидов в надземной части шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi, Lamiaceae) предложены спектрофотометрические методики определения содержания данных соединений в пересчете на скутеллярин и лютеолин-7-гликозид. Относительные ошибки разработанных методик не превышают 4%. Установлено, что содержание флавоноидов в образцах сырья, произрастающего в Читинской области (Россия), составляет 8,24–27,88% в пересчете на скутеллярин, 2,18–6,63% в пересчете на лютеолин-7-гликозид, суммарное содержание флавоноидов – 10,81–33,65%.

Введение
Ранее для количественного определения флавоноидов в надземной части шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi, Lamiaceae) была разработана спектрофотометрическая методика, использующая двухволновое фотометрирование по методу Фирордта [1]. Данная методика позволяет находить количественное содержание 6-оксифлавонов и флаванонов. Учитывая сведения о составе флавоноидов надземной части S. baicalensis [2], следует указать на то, что при анализе по методу Фирордта остаются неучтенными группы флавонов – производных лютеолина и апигенина, т.е. при определении суммарного содержания флавоноидов получаются заведомо заниженные результаты.

Цель работы – разработка методик количественного определения содержания флавоноидов в надземной части S. baicalensis.

Экспериментальные условия
Сырье. В работе были использованы надземная часть шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi), собранная из пяти ценопопуляций (ЦП) Читинской области в 2005–2007 гг. (табл. 1), а также гербарные образцы данного вида из гербария Отдела биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН.

Характеристика исследуемого сырья
ЦП Расположение
SB-1 3 км на запад от станции Приисковая, экспозиция склона – юг
SB-2 северо-запад от станции Приисковая, экспозиция склона – запад
SB-3 2 км на юг от с. Савватеево, экспозиция склона – юг
SB-4 3 км на юго-восток от с. Савватеево вверх по течению горного ручья, экспозиция склона – юго-запад
SB-5 1,5 км на север от с. Умыкей, экспозиция склона – юго-запад

Спектральные исследования проводили на спектрофотометре Cecil 2011. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре UV mini 1240 (Shimadzu). Использовали кварцевые кюветы с толщиной поглощающего слоя 1 см. Температуру плавления устанавливали в запаянных капиллярах на приборе для определения температуры плавления IA-9100. Аналитическую и препаративную хроматографию на бумаге (БХ) проводили на бумаге FN-12 (Filtrak) в системах растворителей: 1 – CH3COOH – H2O (15 : 85), 2 – BuOH – CH3COOH – H2O (4 : 1 : 2); детекторы – УФ-свет, 5% NaOH.
Выделение скутеллярина. 200 г измельченного сырья экстрагировали 70%-ным этиловым спиртом 3 раза в соотношении сырья и растворителя 1 : 10 (100 °С, по 90 мин). Объединенные извлечения концентрировали в вакууме до водного остатка (0,1 л), который подвергали жидкофазной экстракции гексаном и хлороформом, после чего водный остаток подкисляли 20% H2SO4 (pH = 5) и экстрагировали этилацетатом. При жидкофазной экстракции этилацетатом наблюдается выпадение межфазного осадка. Получены следующие фракции: гексановая (5,4 г), хлороформная (4,3 г), этилацетатная (39 г), а также межфазный осадок (2,5 г).

Наличие флавоноидов определяли в этилацетатной фракции и межфазном осадке, для чего исследуемые компоненты растворяли в смеси этанол – ДМСО (1 : 1) и хроматографировали в двух направлениях (БХ, системы растворителей 1, 2). В результате проведенного анализа установлено, что в составе данных фракций присутствуют флавоны (лютеолин, апигенин, скутеллярин).
Удовлетворительное разделение с возможностью отнесения зон к конкретной группе флавоноидов наблюдалось при хроматографировании межфазного осадка. Для более детальной идентификации проведено выделение доминирующего вещества с использованием препаративной БХ (системы растворителей 1, 2) с последующим анализом хроматографического поведения и характера поглощения в УФ- и видимой части спектра в присутствии диагностических добавок в сравнении с данными литературы. Физико-химический анализ позволил идентифицировать соединение как скутеллярин.
Скутеллярин. С21Н18О12. Т.пл. 221ºС. УФ-спектр (λmax, нм): 285, 335; +NaOAc – 286, 333; +NaOH – 375.
Методика количественного определения содержания флавоноидов в надземной части шлемника байкальского. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, приливают 100 мл 70%-ного этилового спирта, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. После охлаждения извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию повторяют еще дважды: со 100 мл экстрагента в течение 60 мин и с 50 мл экстрагента в течение 30 мин. Объем объединенного фильтрата доводят до метки 70%-нымэтиловым спиртом (раствор А).
1 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки 70%-ным этиловым спиртом (раствор Б1). Определяют оптическую плотность раствора Б1 при длине волны 285 нм. В качестве раствора сравнения используют 70%-ный этиловый спирт.

Содержание флавоноидов в пересчете на скутеллярин в абсолютно-сухом сырье в процентах (ХI) вычисляют по формуле где D – оптическая плотность исследуемого раствора; KV – коэффициент разбавления исследуемого раствора (6250); 400 – удельный коэффициент погашения скутеллярина при длине волны 285 нм в 70%-ном этиловом спирте; m – масса сырья, г; W – потеря в массе при высушивании сырья, %.
1 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 1 мл 2%-ного раствора хлорида алюминия в 70%-ном этиловом спирте и доводят объем раствора до метки 70%-ным этиловым спиртом (раствор Б2). Определяют оптическую плотность раствора Б через 40 мин при длине волны 405 нм.

Для приготовления раствора сравнения 1 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки 70%-ным этиловым спиртом. Параллельно определяют оптическую плотность раствора стандартного образца лютеолин-7-гликозида.

Суммарное содержание флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-гликозид в абсолютно сухом сырье в процентах (ХII) вычисляют по формуле, где D – оптическая плотность исследуемого раствора; DS – оптическая плотность раствора стандартного образца лютеолин-7-гликозида; m – масса сырья, г; mS – масса стандартного образца лютеолин-7-гликозида, г;
KV – коэффициент разбавления исследуемого раствора (6250); KVS – коэффициент разбавления раствора стандартного образца лютеолин-7-гликозида (2500); W – потеря в массе при высушивании сырья, %.
Приготовление раствора стандартного образца лютеолин-7-гликозида. Около 0,02 г (точная навеска) лютеолин-7-гликозида, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 105 °С, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 95%-ном этиловом спирте и доводят объем раствора до метки тем же растворителем (раствор А).
1 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 1 мл 2%-ного раствора хлорида алюминия в 95%-ном этиловом спирте и доводят объем раствора до метки 95%-ным этиловым спиртом (раствор Б).

Для приготовления раствора сравнения 1 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки 70% спиртом этиловым.
Суммарное содержание флавоноидов в абсолютно сухом сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле где ХI
– содержание флавоноидов в пересчете на скутеллярин, ХII
– содержание флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-гликозид.

Содержание экстрактивных веществ определяли гравиметрическим методом [3]. При обработке результатов количественных анализов использовали методы математической статистики согласно рекомендациям [4, 5].

Результаты и их обсуждение
Сравнение спектров поглощения извлечений из морфологических групп надземной части S. baicalensis показало, что спектр поглощения спиртового извлечения содержит два экстремума – 285 и 335 нм и является аддитивным в большей степени из спектров поглощения извлечений из стеблей и листьев и в меньшей – из цветков (рис. 1). Спектры поглощения извлечений из корней отличны от таковых органов надземной части. При сравнении вида спектра поглощения спиртового извлечения из надземной части S. baicalensis с полосами 15 индивидуальных соединений, выделенных из данного сырья, установлено, что максимум в области 285 нм обусловлен присутствием скутелляреина, скутеллярина, дигидроскутеллярина и дигидроизоскутеллярина. Широкая полоса поглощения около 335 нм вызвана присутствием скутелляреина, скутеллярина, изоскутеллярина, апигенин-7-глюкуронида.

По данным Т.П. Поповой с соавторами [1], доминирующими соединениями надземной части S.baicalensis являются скутеллярин и дигидроскутеллярин. Присутствие скутеллярина в исследуемом сырье нами было доказано после его препаративного выделения и идентификации. Спектр поглощения скутеллярина совпадает с таковым спиртового извлечения из сырья, поэтому он был выбран нами в качестве стандартного вещества для определения содержания соединений, обладающих максимумом поглощения в области 278–288 нм, который соответствует 6-оксифлавонам и флаванонам. Для расчета использовали величину удельного коэффициента погашения скутеллярина, равного 400 [1].

Максимумы спектров поглощения спиртового извлечения надземной части S. baicalensis и индивидуальных соединений (по данным [3])
Соединение λmax, нм Соединение λmax, нм
Апигенин 270, 340 Изоскутелляреин 282, 308
Апигенин-7-глюкуронид 270, 335 Изоскутеллярин 280, 335
Байкалеин 275, 325 Лютеолин 260, 356
Байкалин 245, 277, 313 Лютеолин-7-глюкуронид 350
Дигидроскутелляреин 294, 358 Скутелляреин 284, 336
Дигидроскутеллярин 286, 362 Скутеллярин 285, 335
Дигидроизоскутелляреин 297, 330, 272 Хризин 270
Дигидроизоскутеллярин 285, 365 Хризин-7-глюкуронид 270, 305
Динатин 275, 325 Спиртовое извлечение 285, 335

Следует отметить, что при анализе данного вида сырья с использованием только прямого варианта спектрофотометрии при длине волны 285 нм остаются неучтенными производные апигенина и лютеолина, так как в их спектрах поглощения полоса II сдвинута в более коротковолновую область. Для устранения этого недостатка нами рассмотрена возможность применения дифференциального варианта анализа. Максимум дифференциального спектра поглощения спиртового извлечения S. baicalensis наблюдается при 405 нм и может быть использован для анализа данной группы соединений, в роли внешнего стандарта выступает лютеолин-7-гликозид (цинарозид) (рис. 2).
При дифференциальном варианте спектрофотометрического анализа предполагается применение алюминия хлорида в качестве комплексообразователя; установлено, что система флавоноиды – AlCl3 достигает равновесия через 40 мин.

В экспериментах по определению оптимальных параметров процесса экстракции флавоноидов, обеспечивающих их максимальное извлечение, исследовалось влияние следующих факторов: тип экстрагента, температура экстракции, степень измельчения сырья, соотношение сырье : экстрагент, кратность и время экстракции (табл. 5). Эффективность экстракции оценивалась по содержанию в извлечениях флавоноидов и экстрактивных веществ.

Экстрагентом, обеспечивающим наиболее полное извлечение флавоноидов, для надземной части S.baicalensis является 70%-ный этиловый спирт, повышение концентрации экстрагента до 95% приводит к снижению выхода флавоноидов до 7,71%. Спектральный анализ извлечений, полученных с применением разных экстрагентов, подтверждает выбор 70%-ного этилового спирта; более высокие концентрации экстрагента приводят к преимущественной экстракции липидов и фотосинтетических пигментов, ухудшающих аналитические характеристики извлечения.

Спектры поглощения спиртовых извлечений морфологических групп S. baicalensis (1 – надземная часть, 2 – листья, 3 – стебли, 4 – цветки, 5 – корни) и скутеллярина (6).
Дифференциальные спектры поглощения спиртовых извлечений надземной части S. baicalensis (1) и лютеолин-7-гликозида (2)

Влияние типа экстрагента на выход БАС
Содержание, % Экстрагент ЭВ* ФI* ФII* Σ Ф* λmax, нм
Вода 28,30 6,02 1,76 7,78 291
EtOH-20% 40,91 9,46 2,52 11,98 288
EtOH-40% 31,02 11,41 2,89 14,30 286, 334, 661
EtOH-60% 36,14 17,37 4,94 22,31 284, 335, 602, 664
EtOH-70% 39,77 20,16 7,09 27,25 285, 335, 605, 664
EtOH-80% 36,48 15,37 5,28 20,65 287, 336, 537,607,664
EtOH-90% 25,23 6,97 2,94 9,91 285, 334, 395, 537, 609, 664
EtOH-95% 20,23 6,12 1,61 7,71 285, 330, 380, 537, 611, 664
* Здесь и далее в таблицах 4 и 5: ЭВ – экстрактивные вещества, ФI – флавоноиды в пересчете на скутеллярин (λ = 285 нм), ФII – флавоноиды в пересчете на лютеолин-7-гликозид (λ = 405 нм), Σ Ф – суммарное содержание флавоноидов.

Влияние температуры экстракции, степени измельчения и соотношения сырье : экстрагент на выход БАС (%)
Температура экстракции, ºС
20 12,27 20,36 1,81 22,17
40 18,18 21,60 3,77 25,37
60 18,18 21,52 3,81 25,33
80 19,09 21,58 5,35 26,93
100 44,43 21,80 7,13 28,93

Степень измельчения, мм
0,25 35,46 9,22 6,86 16,08
0,50 38,98 15,62 7,08 22,70
1,00 39,21 20,66 7,90 28,56
2,00 40,91 27,44 8,52 35,96
3,00 38,07 25,66 7,72 33,38
5,00 37,80 20,84 6,80 27,64
7,00 35,78 5,84 6,52 12,36

Соотношение сырье : экстрагент
1:10 8,86 2,98 1,46 4,44
1:20 22,27 8,13 2,86 10,99
1:30 27,50 11,00 2,90 13,90
1:50 34,09 12,70 3,12 15,82
1:70 43,86 15,40 4,52 19,92
1:100 44,09 17,75 6,08 23,83
1:150 40,23 17,00 4,76 21,76
1:200 36,14 14,86 3,28 18,14

Влияние кратности и времени экстракции на выход БАС (%)
1-й контакт фаз
Время, мин
15 13,18 8,20 1,48 9,68
30 25,00 17,00 4,40 21,40
45 25,45 18,33 4,56 22,89
60 25,68 19,25 4,86 24,11
75 25,65 19,30 4,24 23,54
90 25,67 19,25 3,68 22,93
105 25,67 19,13 3,54 22,67
120 25,60 19,00 2,98 21,98
2-й контакт фаз
Время, мин
30 22,95 5,83 2,59 8,42
60 23,86 8,40 2,94 11,34
90 25,00 8,45 2,49 10,94
120 23,41 8,38 2,63 11,01
3-й контакт фаз
Время, мин
30 4,32 2,14 0,66 2,80
60 4,38 1,86 0,51 2,37
90 4,38 1,86 0,51 2,37
120 4,38 1,14 0,39 1,53
4-й контакт фаз
Время, мин
30 0,18 0,14 - 0,14
60 0,18 0,14 0,08 0,22
90 0,19 0,16 0,08 0,24
120 0,20 0,14 0,08 0,22

Оптимальными выбраны следующие параметры экстракции: экстрагент – 70%-ный этиловый спирт, температура экстракции – 100 ºС, степень измельчения – 2 мм, 1 и 2-й контакты фаз – 1 : 100 по 60 мин, 3-й контакт фаз 1 : 50 по 30 мин. Трехкратная экстракция в данных условиях позволяет извлечь до 99% флавоноидов и экстрактивных веществ; во время 4-й экстракции извлекается не более 0,5% экстрактивных веществ и 0,7% флавоноидов.

Оценку правильности разработанной методики проводили с использованием общепринятых экспериментов: способом «введено – найдено», методом независимых и параллельных определений. При исследовании методики способом «введено – найдено» установлено, что относительная ошибка не превышает 1,5%
Средняя ошибка из трех измерений для трех образцов находится в достаточно узких пределах – 0,02– 0,83% (табл. 7). Таким образом, можно утверждать то, что анализируемый компонент определяется с достаточной точностью, т.е. результаты анализа можно считать правильными. Отклонение от среднего в эксперименте из трех независимых определений не превышает 2%, что свидетельствует об удовлетворительной воспроизводимости методики.
Метрологические характеристики разработанной методики приведены в таблицах 8 и 9. Установлено, что относительная ошибка определения не превышает 4%.
На основании проведенного количественного анализа установлено, что содержание флавоноидов в надземной части S. baicalensis находится в следующих пределах: в пересчете на скутеллярин – 8,24–27,88%, в пересчете на лютеолин-7-глюкозид – 2,18–6,63%, общее содержание флавоноидов – 10,81–33,65%.
Полученные результаты использованы при разработке ФСП «Надземная часть шлемника байкальского».
Показателями качества установлены следующие нормы: содержание флавоноидов в пересчете на скутеллярин должно быть не менее 8%; в пересчете на лютеолин-7-гликозид – не менее 2%; суммарное содержание флавоноидов – не менее 10%.

Результаты эксперимента способом «введено – найдено»
Содержание флавоноидов Ошибка в аликвоте, мкг Введено, мкг Должно быть флавоноидов, мкг
Найдено флавоноидов, мкг абс., мкг отн., %
В пересчете на скутеллярин
254 65 319 317 –2 0,62
254 130 384 387 +3 0,78
254 195 449 446 –3 0,67
254 260 514 518 +4 0,78
254 325 579 584 +5 0,86

В пересчете на лютеолин-7-гликозид
157 40 197 196 –1 0,51
157 80 237 239 +2 0,84
157 120 277 274 –3 1,08
157 160 317 318 +1 0,32
157 200 357 359 +2 0,56

Результаты эксперимента методом независимых определений
№ пробы Повторность Флавоноидов, % Среднее, % Отклонение от среднего, %
В пересчете на скутеллярин
1 1 / 2 / 3 22,42 / 18,51 / 20,22 20,38 0,83 / 0,76 / 0,07
2 1 / 2 / 3 18,23 /18,33 / 20,07 18,88 0,27 / 0,22 / 0,49
3 1 / 2 / 3 19,63 / 18,20 / 20,92 19,58 0,02 / 0,56 / 0,55
В пересчете на лютеолин-7-гликозид
1 1 / 2 / 3 6,99 / 7,93 / 7,55 7,49 0,20 / 0,17 / 0,02
2 1 / 2 / 3 7,28 / 7,41/ 9,65 8,11 0,34 / 0,29 / 0,63
3 1 / 2 / 3 10,48 / 11,26 / 9,86 10,53 0,02 / 0,29 / 0,27

Метрологические характеристики разработанной методики (n = 10, P = 0,95, t(p, f) = 2,26)
ЦП x, % S2 Sx ±Δx, % E, %

Флавоноидов в пересчете на скутеллярин
SB-1 18,05 0,159 0,126 0,285 1,58
SB-2 17,70 0,277 0,168 0,377 2,13
SB-3 26,74 0,136 0,117 0,265 0,99
SB-4 27,88 0,233 0,153 0,346 1,24
SB-5 15,32 0,198 0,141 0,318 2,08

Флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-гликозид
SB-1 4,66 0,017 0,044 0,100 2,15
SB-2 4,38 0,051 0,072 0,162 3,72
SB-3 5,24 0,044 0,067 0,151 2,89
SB-4 5,77 0,059 0,077 0,174 3,02
SB-5 4,99 0,035 0,059 0,135 2,71

Суммарное содержание флавоноидов
SB-1 22,71 0,155 0,125 0,282 1,24
SB-2 22,08 0,337 0,183 0,415 1,88
SB-3 31,98 0,106 0,103 0,234 0,73
SB-4 33,65 0,235 0,153 0,346 1,03
SB-5 20,31 0,217 0,147 0,333 1,64

Содержание флавоноидов в гербарных образцах надземной части S. baicalensis, (x±Δx (E), %)
Флавоноидов в пересчете на Место сбора скутеллярин лютеолин-7-гликозид
Суммарное содержание флавоноидов
Могойтуйский район
с. Хара-Шибирь 16,62±0,17 (1,02) 5,29±0,09 (1,70) 21,91±0,15 (0,69)
с. Догой 16,92±0,18 (1,06) 4,09±0,14 (3,42) 21,03±0,21 (1,00)
с. Нижне-Орловск 14,44±0,38 (2,63) 3,64±0,11 (3,02) 18,08±0,28 (1,55)
с. Зугалай 17,47±0,44 (2,52) 4,75±0,16 (3,37) 22,22±0,33 (1,49)
с. Зугалай 16,03±0,23 (1,43) 4,79±0,16 (3,34) 20,84±0,25 (1,20)
Шилкинский район
падь Кузница 8,24±0,33 (3,99) 2,57±0,09 (3,50) 10,81±0,13 (1,20)
пос. Вершино-Дарасунск 21,00±0,14 (0,67) 4,21±0,20 (3,75) 25,21±0,19 (0,76)
г. Первомайск 9,12±0,29 (3,18) 4,89±0,23 (3,70) 14,01±0,31 (2,21)
Шелопугинский район
с. Тайна 15,72±0,74 (3,71) 5,10±0,18 (3,53) 20,82±0,90 (3,32)
с. Догье 22,10±0,13 (0,59) 6,55±0,12 (1,83) 28,65±0,26 (0,91)
пос. Копунь 16,30±0,30 (1,84) 4,96±0,18 (3,63) 21,26±0,29 (1,36)
Борзинский район
г. Шерловая Гора 16,50±0,12 (0,73) 5,36±0,14 (2,61) 21,86±0,10 (0,46)
Приаргунский район
г. Кличка 14,24±0,11 (0,77) 6,63±0,07 (1,06) 20,87±0,11 (0,53)
Калганский район
с. Калга 14,98±0,23 (1,54) 3,31±0,09 (2,72) 18,29±0,35 (1,91)

Выводы
Для количественного анализа надземной части шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi, Lamiaceae) предложены спектрофотометрические методики с применением прямого (в пересчете на скутеллярин) и дифференциального вариантов анализа (в пересчете на лютеолин-7-гликозид). Установлено, что разработанные методики отличаются удовлетворительными метрологическими характеристиками.

Список литературы
1. Куцык А.В., Середа А.В., Попова Т.П., Рыбаченко А.И., Литвиненко В.И. Спектрофотометрическое определение флавоноидов в траве шлемника байкальского // Фармаком. 1998. №2. С.18–20.
2. Оленников Д.Н., Чирикова Н.К., Танхаева Л.М. Фенольные соединения шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi). Обзор литературы // Химия растительного сырья. 2009. №4. С.89–98.
3. Маликов В.М., Юлдашев М.П. Фенольные соединения растений рода Scutellaria L. Распространение, строение и свойства // Химия природных соединений. 2002. №4. С. 299–324; №5. С. 385–409.
4. Государственная фармакопея СССР. XI изд. М., 1987. Вып. 1. 334 с.
5. Александров Ю.И., Беляков В.И. Погрешность и неопределенность результата химического анализа // Журнал аналитической химии. 2002. Т. 57. №2. С. 118–129.
6. Дёрффель К. Статистика в аналитической химии. М., 1994. 252 с.