ФЛАВОНОИДЫ ЛИСТЬЕВ ГИНКГО ДВУЛОПАСТНОГО Ginkgo biloba L., leaves, flavonoids, ginkgetin, isoginkgetin, nicotiflorin, narcissin, rutin. В.А. Куркин, Д.Г. Буланкин, Е.Д. Даева, В.И. Каденцев Самарский государственный медицинский университет, ул. Чапаевская, 89, Самара (Россия) Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Ленинский просп., 47, Москва(Россия)

Из листьев гинкго двулопастного (Ginkgo biloba L.) выделены и охарактеризованы с использованием 1Н-ЯМР-, УФ-спектроскопии, масс-спектрометрии и различных химических превращений флавоноиды гинкгетин (7,41-диметил-аментофлавон), никотифлорин (3-О-рутинозид кемпферола) и нарциссин (3-О-рутинозид изорамнетина). В сырье данного растения обнаружены также изогинкгетин (41,4111-диметиламентофлавон) и рутин. Гинкгетин, никотифлорин и нарциссин впервые описаны для листьев гинкго двулопастного, культивируемого в Российской Федерации и странах СНГ.

Введение
Гинкго двулопастный (Ginkgo biloba L.) - единственный реликтовый вид типа Гинкговых (семейство Ginkgoaceae), который сохранился до нашего времени с пермского периода палеозойской эры (286-245 млн. лет назад) [1–4]. Гинкго двулопастный произрастает в странах с субтропическим климатом, однако возможности к адаптации этого растения очень высоки, о чем свидетельствует его успешное культивирование в Российской Федерации, в частности, в Краснодарском и Ставропольском краях [1, 2].

Листья гинкго двулопастного входят в Европейскую и Американскую фармакопеи [5-7]. На основе субстанций из листьев гинкго двулопастного в Российской Федерации применяются такие препараты, как танакан, билобил, мемоплант, гинкор форт, гинкор гель [8], однако они производятся за рубежом и являются дорогостоящими. Фармакологическое действие листьев гинкго обусловлено содержанием различных классов биологически активных соединений, включая флавоноиды (флавоноловые гликозиды, бифлавоноиды и др.), а также дитерпены и сесквитерпены [1-4].

Цель настоящей работы - исследование флавоноидного состава листьев гинкго двулопастного, культивируемого в Краснодарском крае как одном из потенциальных регионов для создания промышленной сырьевой базы данного растения.

Экспериментальная часть
Объектами исследования служили листья гинкго двулопастного, культивируемого в Ботаническом саду Краснодара (июль 2009 г.). Воздушносухие листья гинкго двулопастного (200 г) исчерпывающе экстрагировали 70% этиловым спиртом, полученные водноспиртовые экстракты упаривали под вакуумом до густого остатка (около 50 мл). Сгущенный экстракт высушивали на силикагеле L 40/100 и полученный порошок (экстракт+силикагель) наносили на слой силикагеля, сформированный в хлороформе. Хроматографическую колонку элюировали хлороформом и смесью хлороформ - этанол в различных соотношениях (99 : 1, 98 : 2, 97 : 3; 95 : 5; 93 : 7; 90 : 10; 88 : 12; 85 : 15; 80 : 20; 70 : 30). Фракции, содержащие вещества 1-3, подвергали дальнейшей рехроматографии на полиамиде, осуществляя при этом элюирование водой, водноспиртовыми смесями (20, 30, 40, 70%) и 96% этиловым спиртом. В результате проведенной очистки на колонках с полиамидом были получены вещество 1 (элюент - 96% этиловый спирт), вещество 2 (элюент - 40% этиловый спирт) и вещество 3 (элюент - 30% этиловый спирт), дополнительную очистку которых удалось провести путем перекристаллизации из водного спирта. Контроль за разделением веществ осуществляли с помощью ТСХ-анализа на пластинках «Silufol UV 254» и «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системах хлороформ - спирт (6 : 1), а также хлороформ - метанол - вода (26 : 14 : 3).
Спектры ЯМР 1Н получали на приборе «Bruker AM 300» (300 МГц), масс-спектры снимали на масс-спектрометре «Kratos MS-30», регистрацию УФ-спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena).

Соединение 1 (гинкгетин). Кристаллы светло-желтого цвета, состава С32Н22О10, Масс-спектр (70 eV, 200 °С, m/z, %): М+ 566 (100). УФ-спектр (EtOH, Xmax, нм): 271, 330;

Соединение 2 (никотифлорин). Кристаллы светло-желтого цвета, состава С27Н30О15, т.пл. 182-186 °С (водный спирт). УФ-спектр (EtOH, Xmax, нм): 266, 355;

Соединение 3 (нарциссин). Кристаллы желтого цвета из этанола, состава С28Н32О16, т. пл. 173-175 °С (водный спирт). УФ-спектр (EtOH, Xmax, нм): 257, 268 пл., 358;

Обсуждение результатов
Гинкгетин (1) на основе физико-химических констант, данных УФ- и ЯМР- и масс-спектров идентифицирован нами как 7,41-диметиламентофлавон [11 ].

В условиях кислотного гидролиза флавоноиды 2 и 3 расщепляются с образованием кемпферола (3,5,7,41-тетрагидроксифлавон) и изорамнетина (3,5,7,41-тетрагидрокси-3-метоксифлавон) соответственно. Углеводная часть данных гликозидов представлена одинаковыми сахарами - глюкозой и рамнозой. Совокупность физико-химических констант, данных УФ- и ЯМР- и массспектров, а также результатов кислотного гидролиза позволила идентифицировать выделенные флавоноиды как никотифлорин (3-О-рутинозид кемпферола) (2) и нарциссин (3-О-рутинозид изорамнетина) (3).

Доминирующими флавоноидами листьев гинкго двулопастного, культивируемого в Краснодарском крае, являются гинкгетин и никотифлорин, в несколько меньших количествах содержится нарциссин. Изо-гингетин обнаружен нами в качестве примеси в образце гинкгетина, что соответствует данным зарубежных ученых, которые получили эти соединения в виде смеси [11]. Примечательно, что и в другой зарубежной работе гинкгетин (7,41-диметиламентофлавон) и изогинкгетин (41,4111-диметиламентофлавон), будучи близкими по химической структуре, обнаруживаются в виде одного пятна [9].

На наш взгляд, выделение гинкгетина как одного из доминирующих и характерных флавоноидов листьев гинкго двулопастного имеет принципиальное значение. Во-первых, для гинкгетина нами выявлена ноотропная активность, свойственная препаратам гинкго [1-4], а во-вторых, имеются примеры, когда стандартизацию сырья данного растения осуществляют без учета наличия гинкгетина: методом ВЭЖХ обнаруживаются лишь продукты кислотного гидролизата - кемпферол, кверцетин и изорамнетин [5-7, 10], что, на наш взгляд, является ошибочным подходом. Что касается рутина, описанного в литературе для данного растения, то он относится к минорным компонентам и едва обнаруживается на хроматограммах (ТСХ).

Интересно, что в исследуемых зарубежных образцах листьев гинкго двулопастного рутин относительно четко обнаруживается методом ТСХ лишь в сырье из Италии [11].

Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать для определения подлинности сырья гинкго двулопастного ТСХ («Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ», система растворителей: хлороформ - метанол - вода, 26 : 14 : 3). В предложенных условиях хроматографирования после проявления хроматограммы щелочным раствором диазобензолсульфокислоты гинкгетин и изогинкгетин обнаруживаются в виде одного доминирующего пятна желтооранжевого цвета с величиной Rf около 0,9, никотифлорин (второе доминирующее пятно), нарциссин и рутин - в виде желтых пятен с Rf около 0,6, 0,5 и 0,4 соответственно.

На наш взгляд, в данной методике целесообразно использовать стандартный образец рутина, близкий по физико-химическим и спектральным свойствам к основным флавоноидам листьев гинкго двулопастного, так как расчет величины RS позволит повысить объективность методики анализа.

Список литературы
1. Куркин В.А. Фармакогнозия. Самара, 2007. 1239 с.
2. Куркин В.А. Основы фитотерапии. Самара, 2009. 963 с.
3. Wagner H. Pharmazeutische Biologie. Drogen und ihre Inhaltsstoffe. Stuttgar; New York, 1993. 522 s.
4. Sasakia K. Chemistry and biological activities of Ginkgo biloba. Hokkaido, 2007. 177 p.
5. British Pharmacopoeia. Incorporating the Requirements of the 5 Edition of the European Pharmacopoeia 1997 as amended by Supplement 2007. System Simulation Ltd., 2007. 1680 p.
6. United States Pharmacopeia. 31-th Ed., Rockville: United States Pharmacopoeial Convention, Inc., 2008. 2105 p.
7. Фармакопея США, USP 29. Национальный формуляр, NF 24: 2 т. М., 2009. Т. 1. 1720 с.
8. Государственный реестр лекарственных средств. Официальное издание. М., 2008, Т. 1. 1238 с.
9. Wagner H, Bladt S. Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas. Berlin; Heidelberg; New York, 1996. 384 p.
10. Юрьев Д.В., Эллер КН., Арзамасцев А.П. Анализ флавонолгликозидов в препаратах и БАД на основе гинкго билоба// Фармация. 2003. Т. 51,№2. С. 7-10.
11. Hanrahan J.R., Chebib M., Davucheron N.L.M., Belinda H.J., Johnstonb G.A.R. Semisynthetic Preparation of Amento-flavone: A Negative Modulator at GABAA Receptors // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003. Vol. 13. Pp. 2281-2284.

References
1. Kurkin V.A. Farmakognoziia. [Pharmacognosy]. Samara, 2007, 1239 p. (in Russ.)
2. Kurkin V.A. Osnovy fitoterapii. [Fundamentals of phytotherapy]. Samara, 2009. 963 p. (in Russ.)
3. Wagner H. Pharmazeutische Biologie. Drogen und ihre Inhaltsstoffe. Stuttgart; New York, 1993, 522 p.
4. Sasakia K. Chemistry and biological activities of Ginkgo biloba. Hokkaido, 2007, 177 p.
5. British Pharmacopoeia. Incorporating the Requirements of the 5 Edition of the European Pharmacopoeia 1997 as amended by Supplement 2007. System Simulation Ltd., 2007. 1680 p.
6. United States Pharmacopeia, 31-th Ed., Rockville: United States Pharmacopoeial Convention, Inc., 2008. 2105 p.
7. Farmakopeia SShA, USP 29. Natsional'nyi formuliar, NF 24. [United States Pharmacopoeia, USP 29. National Formulary, NF 24] Moscow, vol. 1, 1720 p. (in Russ.)
8. Gosudarstvennyi reestr lekarstvennykh sredstv. Ofitsial'noe izdanie. [State register of medicines. Official edition] Moscow, 2008, vol. 1. 1238 p. (in Russ.)
9. Wagner H., Bladt S. Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas. Berlin; Heidelberg; New York, 1996. 384 p.
10. Iur'ev D.V., Eller K.I., Arzamastsev A.P. Farmatsiia, 2003, vol. 51, no. 2, pp. 7-10.
11. Hanrahan J.R., Chebib M., Davucheron N.L.M., Belinda H.J., Johnstonb G.A.R. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, vol. 13, pp. 2281-2284.