Рассмотрены вопросы по выделению артемизинина из Artemisia annua L. и его количественному определению с помощью метода ВЭЖХ-МС. Выделение артемизинина проводили различными методами экстракции: мацерация, ультразвуковая и докритическая СО2-экстракция. Методом ГХ-МС исследован компонентный состав С02- и гексано-вого экстрактов.
Введение
Артемизинин (1) - это пероксидный сесквитерпен [1], являющийся высокоэффективным противомалярийным препаратом и предшественником более сильнодействующих соединений, таких как артеметер, артесунат и некоторых других. Важность артемизинина и его производных основывается на очень быстром действии соединении данного типа против ее основного возбудителя Plazmodium falciparum, вызывающего к тому же заболевание мозга. Химический и биохимический синтезы артемизинина показали себя весьма дорогостоящими и, следовательно, в настоящее время нежизнеспособными в качестве основного источника получения артемизинина [2].
Малярию вызывает микроорганизм - малярийный плазмодий. Различают 4 вида такого плазмодия, паразитирующего в теле человека: Plazmodium vivax, P. ovale, P. malariae и P. falciparum. В середине XX столетия благодаря широкому применению хинина и его производных удалось существенно снизить число больных малярией. Однако начиная с 60-х гг. прошлого века малярия снова напомнила о себе. Это было вызвано тем, что в Таиланде и Южной Америке появился и распространился по другим регионам малярийный плазмодий (P. falciparum), устойчивый к хинину, хлорокину, мефлокину и другим лекарствам, синтезированным на основе хинолина [3, 4]. Стала актуальной проблема поиска новых эффективных противомалярийных препаратов, среди которых был предложен артемизинин. Это уникальное соединение было открыто в Китае (китайское название qinghaosu). Работы были начаты в 1967 г. и названы «Программа 523» [5]. Его выделяют из полыни однолетней Atemisia annua L., которая распространена на территории бывшего СССР, охватывая районы Алтая, Забайкалья, Приамурья, Казахстана, Киргизии, Узбекистана и Туркменистана. Широко представлена полынь в Китае и других странах [6]. Общая сумма артемизинина, выделенного из разных частей A. annua, составляет около 0,01 и 1,4% от сухой массы листьев [2].
Artemisia annua L. является основным сырьем для получения артемизинина. Всемирная организация здравоохранения в 2001 г. рекомендовала использовать артемизинин в терапии первой линии для борьбы с малярией, что привело к росту посевных площадей полыни однолетней. В основном выращивают полынь однолетнюю в Восточной Азии, главным образом в Китае и Вьетнаме (70% посевных площадей от мирового запаса), недавно ввели в культуру в Восточной и Южной Африке (20% посевных площадей от мирового запаса), что обеспечивает четверть потребности мирового здравоохранения [7].
Помимо артемизинина A. annua ценится за эфирное масло, которое имеет характерный сладкий, травянистый аромат и используется в парфюмерии и косметических изделиях. К тому же масло обладает антибактериальным свойством и может использоваться для лечения кожных заболеваний. Помимо сесквитерпеновых лактонов, которые имеют основное терапевтическое значение, эфирные масла этого растения содержит значительное количество компонентов, имеющих ценность, как например, 1,8-цинеол, артемизиевый спирт и кетон, борнеол и другое в последнее время был изучен жирнокислотный состав полыни однолетней, а также проанализировано физиологическое действие липофильных экстрактов на кожу [2].
В связи с богатым и разнообразным составом биологически активных веществ, содержащихся в Artemisia annua, большой интерес представляет поиск новых районов произрастания полыни однолетней. В Республике Бурятии произрастает 46 видов полыней [8], в том числе Artemisia annua L. Содержание артемизинина в польши однолетней, произрастающей в Бурятии, ранее не было изучено. Поэтому целью данной работы стало количественное определение артемизинина в экстрактах, полученных различными методами экстракции.
Экспериментальная часть
Сырьем для исследования была выбрана надземная часть польши однолетней Artemisia annua L., собранная в первой декаде августа 2010 г., в фазу цветения.
Выделение артемизинина и других биологически активных веществ (эфирное масло) проводили с применением различных методов экстракции: мацерация, ультразвуковая экстракция и докритическая СО2-экстракция. Экстракция проводилась на лабораторных установках. В качестве экстрагентов использовали гексан, этилацетат, этанол и CO2. Данные и параметры экстракции приведены в таблице 1. Экстракты от осадка отделяли центрифугированием на центрифуге ОП-8УХЛ4.2 при 5000 об./мин, а затем фильтровали через систему фильтрации образцов.
Количественное содержание артемизинина определяли методом ВЭЖХ-МС с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа марки «Finnigan Surveyor», оснащенного автосамплером «autosampler Plus» и насосом «LC Pump Plus», с массселективным детектором «LCQ Advantage MAX» (ионная ловушка) марки «Finnigan», способ ионизации - электроспрей. Колонка «Hypersyl Gold» 150×4 мм, заполненная сорбентом на основе силикагеля с привитыми фазами С18 (размер частиц 5 мкм), (производство Thermo electronic corporation, США). Элюирование проводили в изократическом режиме (50%(А) : 50%(Б)), состав стартового буфера (А) - водный раствор муравьиной кислотой, (рН=3) + 2 мл насыщенного раствора ацетата аммония, элюирующего буфера (Б) - 100% ацетонитрил. Объемная скорость потока элюента - 0,5 мл/мин, объем вводимой пробы (автосамплером) 25 мкл. Регистрация ионов проводилась в режиме мониторинга положительно заряженных ионов (Selected Ion Monitoring, SIM), с молекулярнои массой 300 (за счет присоединения к молекуле артемизинина иона аммония NH4 ) с шириной окна (299-301) m/z. Количественное определение проводили методом внутреннего стандарта с использованием государственного стандартного образца фирмы Sigma.
Методы и параметры экстракции
№ п/п Метод экстракции Экстрагент Время экстракциии / параметры экстракции Содержание артемизинина в %, в пересчете на а.с.с.
1 Мацерация этанол 24 ч / соотношение сырье : растворитель (1 : 5) 0,040±0,002
2 Мацерация этанол 48 ч / соотношение сырье : растворитель (1 : 5) 0,038±0,002
3 Мацерация гексан 24 ч / соотношение образец : растворитель (1 : 5) 0,039±0,002
4 УЗ-экстракция этанол 15 мин / соотношение сырье : растворитель (1 : 5), частота озвучивания 50 Гц, T=25 °C 0,039±0,002
5 УЗ-экстракция этилацетат 15 мин / соотношение сырье : растворитель (1 : 5), частота озвучивания 50 Гц, T=25 °C 0,022±0,001
6 СО2-экстракция со2 24 ч / скорость потока 30 л/ч, Т=20-22 °С, Р=6,0-6,2 МПа 0,054±0,003
Дополнительно были исследованы легколетучие компоненты СО2- и гексанового экстрактов методом хромато-массспектрометрии на газовом хроматографе Agilent Packard HP 6890 с квадрупольным детектором MSD 5973N. В работе использовали 30-метровая кварцевая колонка TR-5 ms с внутренним диаметром d = 0,25 мм, толщина пленки 0,25 µм. Хроматографическое разделение проводили так, как описано в [9]. Качественно компоненты экстрактов определяли, сравнивая полные массспектры с данными библиотеки хроматомассспектрометрических данных летучих веществ растительного происхождения А.В. Ткачева, библиотек NIST 08 и Wiley 275. Результаты анализа представлены в таблице 2.
Основные компоненты СО2- и гексанового экстрактов
Площадь пика относительная Соединения Площадь пика относительная
Соединения СO2-экстракт гексановый экстракт
СO2-экстракт Гексановый экстракт
Монотерпеноиды Длинноцепочечные углеводороды
Трициклен 140181 – Трикозан 103969 52288
а-пинен 1155320 – Трикозен-1 1956324 –
Камфен 2021028 – н-пентакозан 534763 110485
Р-пинен 371548 1683858 645634 – – –
н-гептакозан 279800 132358
3-карен
Циклические углеводороды
Лимонен
Пентацикло 576196 –
Р-фелландрен 587143 – [7.5.0.0(2,8).0(5,14)0.
1,8-цинеол 133599 – (7,11)]тетрадекан
Артемизиа кетон 1413437 – 1,8-диметилфенантрен 3765681 1080289
Борнеол 170158 707945 – – Флюорен 3507465 319501
Борнил ацетат
Дитерпеноиды
Сесквитерпеноиды
Метил 3,5-бис(этиламино)бензоат 627581 283913
Кариофиллен 370714 214560 – –
Окись кариофиллена
Гермакрен Д 214913 –
Р-селинен 3053333 328535
а-кадинол 149485 –
Обсуждение результатов
Как видно из данных, приведенных в таблице 1, наименьший выход артемизинина составил (0,022%) при ультразвуковой экстракции этилацетатом. Содержание артемизинина в экстрактах, выделенных ультразвуковой экстракцией и мацерацией, с использованием различных растворителей (гексана, этилового спирта) существенно не отличается 0,038-0,040% в пересчете на а.с.с. При настаивании этиловым спиртом полыни однолетней 24 и 48 ч содержание артемизинина в полученных экстрактах примерно одинаково 0,040 и 0,038% соответственно. Наибольший выход артемизинина (0,054%) получен при до критической СО2-экстракции. Для сравнения приведем некоторые данные о содержании артемизинина, в полыни однолетней, произрастающей на различных территориях. В Artemisia annua L., произрастающей в различных районах Китая, содержится от 0,01 до 0,22% артемизинина. В некоторых гибридах полыни однолетней, культивируемых в Китае и во Вьетнаме содержится от 1,0-1,5% артемизинина [10]. Содержание артемизинина в A. annua, произрастающей на территории бывшего СССР, следующее (значения приводятся в пересчете на воздушносухое сырье): Грузинская ССР (0,005%), Киргизская ССР (0,025%), Молдовская ССР (0,01-0,02%), Краснодарский край (0,04%), Украинская ССР (0,005-0,05%), Туркменистан (0,05% в пересчете на а.с.с), Казахстан (0,01-0,05% в пересчете на а.с.с.) [11].
При исследовании состава экстрактов полыни однолетней, полученных СО2-экстракцией и мацерацией, когда в качестве экстрагента использовали гексан, методом хромато-массспектрометрии обнаруживаются значительные различия в составе этих экстрактов. Методом хроматомассспектрометрии обнаруживаются монотерпеноиды, сесквитерпеноиды, длинноцепочечные углеводороды, циклические углеводороды и дитерпеноиды.
Монотерпеноиды обнаружены только в СО2-экстракте. Основными компонентами СО2-экстракта являются а-пинен, 3-карен, артемизиа кетон, (3-селинен, трикозен-1, 1,8-диметилфенантрен и флюорен.
В гексановом экстракте полыни однолетней методом хромато-масс-спектрометрии идентифицированы в основном длинноцепочечные углеводороды и циклические углеводороды, из сесквитерпеноидов был обнаружен 3-селинен.
Помимо артемизинина, который представляет основное лекарственное значение, эфирное масло содержит большое количество компонентов, имеющих биологическую ценность, как, например, артемизиа кетон, 1,8-цинеол, борнеол и др.
Выводы
1. Методом ВЭЖХ-МС определено содержание артемизинина в различных экстрактах A. annua (надземная часть, фаза цветения), произрастающей на территории Республики Бурятии.
2. Максимальное содержание артемизинина обнаружено в СО2-экстракте (0,054% в пересчете на а.с.с),
3. С помощью хроматомассспектрометрии изучен состав эфирного масла, выделенного различными методами экстракции.
Список литературы
1. Племенков В.В. Химия изопреноидов. Барнаул, 2007. 321 с.
2. Lapkin A.A., Plucinski P.K., Cutler M. Comparative assessment of technologies for extraction of artemisinin // J. Nat. Prod. 2006. V. 69. Pp. 1653-1666.
3. Бородулина Б.В. Медицинский энциклопедический словарь. М., 2002. 704 c.
4. Xiao Wang, Xian-en Zhao, Bin Yang, Hongjing Dong, Dahui Liua, Luqi Huanga. A combination of ultrasonic-assisted extraction with RRLC-QQQ method for the determination of artemisinin in the Chinese herb Artemisia annua L. // Phytochem. Anal. 2011. V. 22. Pp. 280-284
5. Денисов Е.Т., Солодова С.Л., Денисова Т.Г. Радикальная химия артемизинина // Успехи химии. 2010. Т. 79, №11. С. 1065-1088.
6. Толстикова Т.Г., Толстиков А.Г., Толстиков Г.А. Лекарства из растительных веществ. Новосибирск, 2010. 215 с.
7. Ferreira J.F., Luthria D.L. Drying affects artemisinin, dihydroartemisinic acid, artemisinic acid, and the antioxidant capacity of Artemisia annua L. leaves // J. Agric. Food Chem. 2010. V. 58. Pp. 1691-1698
8. Определитель растений Бурятии / под ред. О.А. Аненхонова. Улан-Удэ, 2001. 533 с.
9. Ткачев А.В., Королюк Е.А., Юсубов М.С., Гурьев A.M. Изменение состава эфирного масла при разных сроках хранения сырья//Химия растительного сырья. 2001. №1. С. 19-30.
10. Ferreira J.F.S., Laughlin J.C., Delabays N., Magalha P. M. Cultivation and genetics of Artemisia annua L. for increased production of the antimalarial artemisinin // Plant Genetic Resources. 2005. V. 3, N2. Pp. 206-229
11. Претер А.И., Рыбалко К.С., Коновалова О.А., Деревинская Т.И., Майсурадзе Н.И., Макарова Н.В. Содержание артемизинина в Artemisia annua L. // Растительные ресурсы. 1989. Вып. 1. С. 66-72.