Из коры крушины ломкой (Frangula alnus Mill.) выделены франгулин А (6-О-а-L-рамнопиранозид франгула-эмодина) и франгулин В (6-О-Р-D-апиофуранозид франгула-эмодина). На основе результатов исследования обоснованы методологические подходы к стандартизации сырья, заключающиеся в использовании стандартного образца франгулина А (доминирующий антрагликозид) в аналитических методах. Разработаны методики определения подлинности сырья крушины с использованием тонкослойной хроматографии и УФ-спектроскопии.
Введение
Кора крушины ломкой (Frangula alnus Mill.) служит источников целого ряда лекарственных слабительных средств [1-4]. В соответствии с Государственной фармакопеей СССР XI издания раздел «Качественные реакции» в фармакопейной статье «Кора крушины ломкой» (ст. 2) включает лишь пробирочные реакции [5]. Используемая в данной нормативной документации реакция с 10% раствором гидроксида натрия (при смачивании внутренней поверхности коры 1-2 каплями наблюдается кроваво-красное окрашивание), а также реакция Борнтрегера не потеряли своей актуальности, однако в случае лекарственных средств (отвар, экстракт жидкий, экстракт сухой, сироп и др.) они не позволяют в полной мере решать проблему определения подлинности. Одним из перспективных методов определения подлинности растительного сырья является тонкослойная хроматография (ТСХ) [2, 6], однако использование ТСХ возможно лишь на основе глубокого изучения компонентного состава лекарственных растений. На наш взгляд, внедрению современных методов анализа коры крушины ломкой и препаратов на ее основе препятствует противоречивость данных относительно компонентного состава антрагликозидов данного сырья. Так, в отечественной литературе сообщается о наличии в коре крушины ломкой окисленных форм франгуларозида -глюкофрангулина и франгулина (производные франгулаэмодина) [4, 7], тогда как зарубежные ученые ориентируются на глюкофрангулин А и В, а также франгулин А и В [6, 8, 9]. В соответствии с этим в Европейской фармакопее предусмотрен перерасчет на глюкофрангулин А содержания суммы производных антрацена, или суммы глюкофрангулинов [10].
Цель настоящей работы - исследование компонентного состава антрагликозидов коры крушины ломкой.
Экспериментальная часть
Объектом настоящего исследования служили образцы коры крушины ломкой, заготовленные в Ботаническом саду Самарского государственного университета в апреле-мае 2009 г., а также промышленный образец сырья (ПКФ «Фитофарм» Краснодарского края). Кору крушины ломкой (200 г) подвергали исчерпывающему экстрагированию 70% этиловым спиртом, сочетая при этом способ мацерации (24 ч) с последующей термической экстракцией при температуре 85-90 °С. Водно-спиртовые экстракты упаривали под вакуумом до густого остатка (около 50 мл). Сгущенный экстракт высушивали на силикагеле L 40/100 и полученный порошок (экстракт+силикагель) наносили на слой силикагеля, сформированный в хлороформе. Хроматографическую колонку элюировали хлороформом и смесью хлороформ-этанол в различных соотношениях (97 : 3; 95 : 5; 93 : 7; 90 : 10; 85 : 15; 80 : 20; 70 : 30, 60 : 40, 50 : 50). Контроль за разделением веществ осуществляли с помощью ТСХ-анализа на пластинках «Silufol UV 254» и «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системах хлороформ - этанол (4 :1), а также хлороформ - метанол - вода (26 : 14 : 3). Фракции, содержащие вещества 1 и 2, были объединены, а выпавшие из них осадки отделены и затем перекристиллизованы из водного спирта.
Спектры ЯМР 1Н выделенных веществ 1 и 2 получали на приборах «Bruker AM 300» (300 МГц), масс-спектры снимали на масс-спектрометре «Kratos MS-30», регистрацию УФ-спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena).
Соединение 1. 6-0-а-L-рамнопиранозид франгула-эмодина (франгулин А), кристаллы оранжевого цвета состава С21Н20О9, т.пл. 227-230 °С (водный спирт). УФ-спектр (EtOH, Xmax, нм): 225, 262, 285, 300 пл, 434. Cпектр ЯМР 1Н (300 МГц, ДМСО-d6, 5, м.д., J/Гц): 1,14 (3Н, д, J = 6, СН3 рамнозы), 2,40 (3Н, с, ароматическая СН3 при С-3), 3,3-4,2 (4Н рамнозы), 5,60 (Ш, уширенный синглет, Н-11 рамнопиранозы), 6,87 (Ш, д, J = 2,5, Н-2), 7,12 (1H, с, Н-7), 7,23 (1H, c, J = 2,5, Н-4), 7,47 (1H, с, Н-5), 11,85 (1H, c, 5-ОН группы), 12,00 (1H, c, 8-ОН группы). При кислотном гидролизе франгулин А расщепляется на рамнозу и агликон, представляющий собой франгула-эмодин (1,6,8-тригидрокси-3-метилантрахинон): М+агликона 270 (30%), 256 (100%).
Соединение 2. 6-0-Р-О-апиофуранозид франгула-эмодина (франгулин В), кристаллы оранжевого цвета состава С20Н18О9, М+ агликона 270 (30%), 256 (100%), т. пл. 184-187 °С (водный спирт). УФ-спектр (EtOH, Хmax, нм): 224, 263, 285, 300 пл, 434. Cпектр ЯМР 1Н (300 МГц, ДМСО-d6, 5, м.д., J/Гц): 2,28 (3Н, с, ароматическая СН3 при С-3), 3,2–4,3 (4Н апиофуранозы), 5,58 (Ш, д, J = 4, Н-11 апиофуранозы), 6,82 (Ш, д, J = 2,5, Н-2), 7,12 (1H, с, Н-7), 7,20 (1H, c, J = 2,5, Н-4), 7,43 (1H, с, Н-5), 11,84 (1H, c, 5-ОН группы), 11,98 (1H, c, 8-ОН группы). При кислотном гидролизе франгулин В расщепляется на апиозу и агликон, идентифицированный как франгула-эмодин (1,6,8-тригидрокси-3-метилантрахинон): М+ агликона 270 (30%), 256 (100%).
Обсуждение результатов
Франгулин А и франгулин В впервые в Российской Федерации выделены из коры крушины ломкой, что соответствует зарубежным литературным данным и создает перспективу критического пересмотра методов стандартизации сырья и препаратов данного растения. Исследование методом ТСХ показало, что доминирующим антрагликозидом коры крушины ломкой является франгулин А (рис. 1). На хроматограмме водноспиртового извлечения коры крушины ломкой обнаружены также франгулин В и франгула-эмодин (рис. 1). Кроме того, литературные данные [6] позволяют идентифицировать еще два антрагликозида - глюкофрангулин А и глюкофрангулин В (рис. 1). Результаты проведенных исследований позволяют для определения подлинности коры крушины ломкой рекомендовать ТСХ, причем с использованием стандартного образца франгулина А, имеющего, на наш взгляд, особое диагностическое значение для сырья данного растения.
Схема тонкослойной хроматограммы компонентов коры крушины ломкой:
1 - водно-спиртовое извлечение сырья;
2 - франгулин А;
3 - франгулин В;
4 - франгула-эмодин;
5 - глюкофрангулин А;
6 - глюкофрангулин В
На наш взгляд, для целей идентификации коры крушины ломкой целесообразно также использовать метод УФ-спектроскопии, рекомендованный нами для количественного определения суммы антраценпроизводных в сырье данного растения [11]. Используемый при этом испытуемый раствор в отличие от раствора исходного водно-спиртового извлечения коры крушины ломкой имеет характерный максимум поглощения при длине волны 524 нм + 2 нм (рис. 2), соответствующий таковому раствора франгулина А (в присутствии щелочно-аммиачного раствора).
Таким образом, результаты исследования компонентного состава антрагликозидов коры крушины ломкой позволили установить, что доминирующим веществом данного сырья является франгулин А (6-0-a-L-рамнопиранозид франгула-эмодина), что может быть использовано для целей стандартизации с использованием ТСХ и спектрофотометрии.
Электронные спектры раствора водно-спиртового извлечения коры крушины ломкой (1), испытуемого раствора (2) и раствора франгулина А (в присутствии щелочно-аммиачного раствора) (3)
Выводы
1. Из коры крушины ломкой (Frangula alnus Mill.) впервые в Российской Федерации выделены франгулин А (6-0-а-L-рамнопиранозид франгула-эмодина) и франгулин В (6-О-Р-D-апиофуранозид франгула-эмодина).
2. Разработана методика определения подлинности сырья крушины с использованием тонкослойной хроматографии путем обнаружения доминирующего антрагликозида франгулина А в присутствии соответствующего стандартного образца.
3. Наличие в электронном спектре испытуемого раствора коры крушины ломкой максимума поглощения при длине волны 524 нм + 2 нм (в присутствии щелочно-аммиачного раствора), соответствующего спектральным характеристикам франгулина А, следует рассматривать как диагностический признак сырья данного растения.
Список литературы
1. Георгиевский В.П., Комисаренко Н.Ф., Дмитрук СЕ. Биологически активные вещества лекарственных растений. Новосибирск, 1990. 333 с.
2. Куркин В.А. Фармакогнозия : учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов). 2-е изд., пере-раб. и доп. Самара, 2007. 1239 с.
3. Куркин В.А. Основы фитотерапии : учебное пособие для студентов фармацевтических вузов. Самара, 2009. 963 с.
4. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия : учебник. М., 2002. 656 с.
5. Государственная Фармакопея СССР. Одиннадцатое издание. Вып. 2. М., 1990. 400 с.
6. Wagner H, Bladt S. Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas. Berlin - Heidelberg - New York, 1996. 384 p.
7. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейство Rutaceae - Elaeagnaceae. Л., 1988. С. 182-186.
8. Wagner H. Pharmazeutische Biologie. Drogen und ihre Inhaltsstoffe. Stuttgart-New York: Gustav Fischer Verlag, 1993. 522 s.
9. Muzychkina R.A. Natural Anthraquinones. Biological properties and physicochemical characteristics / Ed. by G.A. Tolstikov. Moscow, 1998. 864 p.
10. European Pharmacopoeia. 4-th Ed. Rockville: United States Pharmacopoeial Convention, Inc., 2002. Pp. 1224-1225.
11. Куркин В.А., Шмыгарева А.А. Определение антраценпроизводных в коре крушины // Фармация. 2010. Т. 58, №8. С. 9-12.