Е.Н. Медведева, Н.А. Неверова, Т.Е. Федорова, В.А. Бабкин, Е.С. Метелева, А.В. Душкин, Т.Г. Толстикова, М.В. Хвостов , М.П. Долгих Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, ул. Фаворского, 1,Иркутск (Россия), Институт химии твердого тела и механохимии СО РАН,ул. Кутателадзе,18, Новосибирск (Россия), Новосибирский институт органической химии СО РАН, пр. Академика Лаврентьева, 9, Новосибирск Россия
Методами гельпроникающей хроматографии и количественной спектроскопии ЯМР 13С установлено, что механохимическая обработка арабиногалактана, выделенного из древесины лиственницы сибирской, приводит к изменению молекулярно-массового распределения, моносахаридного состава и степени разветвленности его макромолекул. Это обусловлено процессами частичной деструкции макромолекул полисахарида и последующей рекомбинации образовавшихся фрагментов. Глубина протекания этих процессов зависит от условий механохимического воздействия. На основе данных ИК и ЯМР 13С спектров сделан вывод об отсутствии функционализации макромолекул АГ в изученных условиях. Изучены токсикофармакологические свойства механообработанного АГ. Острая токсичность его составляет >5000 мг/кг.
Введение
В последние годы растительные полисахариды находят все более широкое применение в качестве лечебных и лечебно-профилактических средств [1]. Одним из наиболее перспективных является водорастворимый полисахарид арабиногалактан (АГ) из древесины лиственницы, обладающий высокой биологической активностью (иммуномодулирующая, пребиотическая, гиполипидемическая, митогенная, антимутагенная, гепатопротекторная, гастропротекторная мембранотропность и др.). Он характеризуется также комплексом других чрезвычайно ценных свойств (низкая токсичность, хорошая растворимость в холодной воде, уникально низкая вязкость концентрированных водных растворов, способность связывать жир и удерживать влагу, диспергирующие свойства и др.). Совокупность этих свойств открывает широкие перспективы использования АГ в медицине, ветеринарии, пищевой и косметической промышленности [2, 3]. Значительный интерес для различных отраслей народного хозяйства, и в первую очередь для медицины, представляют продукты модифицирования АГ [2]. Известно, что арабиногалактан и его окисленные формы способны к образованию межмолекулярных комплексов [4–6], а также к химическому взаимодействию с лекарственными веществами [7–12]. Разработан новый подход к синтезу гибридных наноразмерных металлосодержащих биокомпозитов на основе полимерной матрицы АГ [13]. Имеются сведения о том, что продукты окислительной деструкции АГ под действием пероксида водорода [14] проявляют более высокую биологическую активность по сравнению с исходным полисахаридом [15, 16]. Использование АГ в качестве матрицы-носителя фармаконов позволит снизить токсичность, обеспечить биодоступность и пролонгированность действия последних. При этом может наблюдаться усиление терапевтического действия фармакона [16, 17].
Перспективным способом химической модификации АГ является механическая обработка ударноистирающими воздействиями, осуществляемая в специальных мельницах – механохимических активаторах.
Механохимический путь позволяет получать целевые продукты модификации без участия растворителей, в одну технологическую стадию. Установлено снижение токсичности и повышение биодоступности известных лекарственных средств при совместной механохимической обработке их с АГ, что позволило на порядок уменьшить лечебную дозу этих препаратов [18]. Однако в условиях механохимического воздействия возможны многочисленные физико-химические превращения макромолекул арабиногалактана, связанные, во-первых, с разрывом и образованием валентных связей, а во-вторых, с разрушением и возникновением более слабых межмолекулярных взаимодействий (разупорядочение, конформационные превращения и т.д.)[19]. Все это, в свою очередь, может привести к изменению биологической активности и токсикофармакологических свойств полисахарида.
Цель настоящей работы – исследование изменений строения и молекулярной массы АГ, выделенного из древесины лиственницы сибирской, в результате механохимической обработки в различных условиях и изучение влияние такого воздействия на его токсико-фармакологические свойства.
Экспериментальная часть
Для исследований использовали два образца арабиногалактана: АГ-1 и АГ-2, полученные из различных партий древесины лиственницы по разработанному нами способу [20, 21]. Образец АГ-1 использовали без очистки, АГ-2 дополнительно очищали переосаждением. Препараты АГ переосаждали из 10%-ных водных растворов в пятикратный объем этанола.
Для проведения механохимической обработки использовали планетарную мельницу АГО-2 с объемом барабана 40 мл. Режим обработки: ускорение мелющих тел 60 g, мелющие тела – стальные шары диаметром 6 мм, загрузка 75 г, масса обрабатываемой смеси 3 г. Максимальное время обработки составляло 15 мин.
Использовали также мягкий режим механической обработки, для этого применялась валковая мельница ВМ-1 с барабаном, имеющим фторопластовую футеровку. В качестве мелющих тел использовались стальные шары (марка стали ШХ-15) диаметром 15 мм, загрузка 675 г. Ускорение мелющих тел – 1 g (свободное падение). Объем барабана – 300 мл. Общая загрузка компонентов обрабатываемой смеси составляла 20 г, продолжительность механической обработки – от 2 до 12 ч.
Молекулярно-массовое распределение (ММР) образцов исследовали методом гельпроникающей хроматографии (ГПХ) на колонке (1,0 × 65 см) с сефадексом G 100, откалиброванной по декстранам с молекулярными массами 10500, 20000, 41272, 70000 и D-галактозе. В качестве растворителя и элюента использовали 1 М раствора NaCl. Отбирали фракции по 1 мл со скоростью элюирования 15–17 мл/ч. Содержание АГ во фракциях определяли фенол-сернокислотным методом [22]. ИК-спектры образцов сняты в таблетках с KBr на спектрофотометре «Specord 75 IR» в интервале 500–4000 см–1.
Спектры ЯМР 13С образцов АГ регистрировали на спектрометре Bruker DPX 400 с рабочей частотой 100 МГц, растворитель – D2О. Внутренним стандартом служил дейтероацетон. В качестве релаксанта использовался трис-ацетилацетонат хрома Cr(AcAc)3 в концентрации 0,02 М.
При измерении интенсивностей резонансных сигналов на спектрометре ЯМР устанавливался следующий режим работы: ширина развертки – 30000 Гц; длительность импульса – 90о; релаксационная задержка – 8 с; соотношение сигнал/шум – не менее 200; стабилизация резонансных условий осуществлялась по сигналу дейтерорастворителя; температура в датчике была постоянной и составляла 298±0,1К.
Соотношение звеньев галактозы и арабинозы в составе макромолекул АГ рассчитывали по соотношению интегральных интенсивностей сигналов аномерных атомов углерода галактозы и арабинозы (Gal/Ara).
Токсико-фармакологические тесты. Изучение фармакологической активности и определение острой токсичности механически обработанного арабиногалактана АГ-1 проводили на белых беспородных мышах массой 18–20 г и крысах массой 150–200 г, предоставленных лабораторией экспериментальных животных ИЦиГ СО РАН. Животные содержались в стандартных условиях, со свободным доступом к пище и воде.
Определение острой токсичности проводили на мышах по методу Кербера при однократном внутрижелудочном введении.
Влияние арабиногалактана на центральную нервную систему оценивали с использованием стандартного теста «открытое поле». Эффект оценивался по изменению количества различных видов движений и общего эмоционального состояния животных. Регистрация двигательных актов производилась автоматически в установке «TRUSCAN» («Coulbourn instruments», США). Арабиногалактан вводили мышам однократно внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг за час до воспроизведения теста. В качестве эталона сравнения служил анксиолитик сибазон, вводимый в терапевтической дозе 2,5 мг/кг по аналогичной схеме.
Оценку воздействия АГ на артериальное давление (АД) и параметры электрокардиограммы (ЭКГ) животных изучали на крысах путем внутривенного введения в дозах 3,5 и 0,35 мг/кг. ЭКГ регистрировалась во втором стандартном отведении, артериальное давление контролировалось путем введении канюли в сонную артерию животного. Все параметры фиксировались при помощи прибора фирмы «Coulbourn instruments» (США). Анализ ЭКГ и АД проводился с помощью программы National Instruments LabVIEW 5.1. Обработку данных вели с помощью программы «Statistica 6.0» посредством усреднения основных показателей систолического АД. В качестве отклонения от среднего значения использовалась средняя статистическая ошибка, в качестве критерия достоверности был взят t-критерий Стьюдента.
Обсуждение результатов
Механохимическая обработка является перспективным методом повышения реакционной способности органического сырья природного происхождения. Имеются данные о влиянии механодеструкции бурых углей на состав и свойства выделяемых из них гуминовых кислот – высокомолекулярных природных полимеров нерегулярного строения [23].
Ранее нами было показано, что молекулярно-массовые характеристики и моносахаридный состав макромолекул АГ зависят от способа выделения и очистки препаратов [24]. Следовало ожидать, что интенсивное механическое воздействие также вызовет изменение этих важнейших свойств полисахарида.
По данным ГПХ, исходный образец АГ-1 имеет среднюю молекулярную массу 13490 Да и характеризуется довольно узким ММР (табл. 1). После переосаждения его средняя молекулярная масса увеличивается, вероятно, за счет удаления низкомолекулярных фракций, которые растворяются в осадителе – этиловом спирте [14, 24]. Их содержание в АГ-1 составляет 15% (табл. 1). Данные ИК-спектров исходного и очищенного переосаждением образцов идентичны и совпадают с представленными в работе [25]. В результате механохимической обработки в интенсивном режиме (в планетарной мельнице АГО-2) уже через 3 мин. происходит деструкция макромолекул полисахарида, что подтверждается существенным снижением выхода не растворимых в этаноле высокомолекулярных фракций и значительным увеличением ММР. Эти процессы углубляются с увеличением продолжительности обработки (табл. 1, рис. 1). Кроме того, на гель-хроматограммах появляются пики, соответствующие более высоким, чем у исходных образцов, молекулярным массам. Вероятно, в процессе обработки, наряду с деструкцией макромолекул полисахарида с образованием олигомеров, происходит рекомбинация образующихся фрагментов. Подтверждением этого может также служить несколько более высокий выход высокомолекулярных фракций после переосаждения образцов, обработанных в АГО-2 в течение 6–15 мин (образцы 3а, 4а, 5а) по сравнению с образцом, обработанным 3 мин.
После обработки образца АГ-1 в «мягких» условиях (ВМ-1) более ярко выражены процессы рекомбинации, и, как следствие, средняя ММ макромолекул полисахарида снижается в меньшей степени (рис. 2), при этом ММР увеличивается значительно больше (табл. 1, опыт 6).
Представлялось интересным исследовать продукты механохимической обработки арабиногалактана, дополнительно очищенного переосаждением (АГ-2). Переосажденные образцы АГ-1 и АГ-2 имеют практически одинаковые молекулярно-массовые характеристики, (табл. 1, образцы 1а и 7 соответственно), что подтверждает вывод о влиянии способа очистки на ММР макромолекул АГ.
Данные свидетельствуют о том, что предварительное удаление низкомолекулярных фракций несколько снижает степень деструкции макромолекул полисахарида после механохимического воздействия, что выражается в снижении значений ММР.
Идентичность ИК-спектров всех исследованных образцов свидетельствует о том, что деструкция макро- молекул АГ при механохимической активации не сопровождается окислительными процессами. Это подтверждается также отсутствием в спектрах ЯМР 13С образцов АГ сигналов в области 160–220 м.д.
Для образца АГ-1, обработанного в мельнице АГО-2, подвергшегося значительной механодеструкции, были проведены токсико-фармакологические исследования. Установлено, что определенная для данного образца ЛД50, составившая более 5000 мг/кг, фактически не отличается от среднесмертельной дозы исходного арабиногалактана.
В тесте «открытое поле» при изучении воздействия на центральную нервную систему вышеуказанного препарата в дозе 20 мг/кг впервые показана аналогичная сибазону противотревожная активность (табл. 3), проявляющаяся в увеличении времени и количества исследованных отверстий и количества вертикальных стоек у животных.
Кроме того, установлено, что механически обработанный образец при однократном внутривенном введении в дозе 3,5 мг/кг незначительно (на 6%), но достоверно понижает артериальное давление у нормотензивных крыс и не оказывает воздействия на параметры ЭКГ и частоту сердечных сокращений.
Выводы
Все вышесказанное позволяет сделать вывод об отсутствии токсического действия АГ, подвергшегося довольно глубокой механодеструкции.
Совокупность полученных результатов свидетельствует о перспективности применения механохимической модификации арабиногалактана для его использования в качестве матрицы-носителя лекарственных веществ.
Список литературы
1. Криштанова Н.А., Сафонова М.Ю., Болотова В.Ц. Перспективы использования растительных полисахаридов в качестве лечебных и лечебно-профилактических средств // Вестник ВГУ. Серия химия. Биология. Фармация.2005. №1. С. 212–221.
2. Медведева Е.Н., Бабкин В.А., Остроухова Л.А. Арабиногалактан лиственницы – свойства и перспективы использования (обзор) // Химия растительного сырья. 2003. №1. С. 27–37.
3. Медведева С.А., Александрова Г.П. Стратегия модификации и биопотенциал природного полисахарида арабиногалактана // Панорама современной химии России. Синтез и модификация полимеров. М., 2003. С. 328–356.
4. Бадыкова Л.А. Взаимодействие арабиногалактана сибирской лиственницы с 5-аминосалициловой кислотой,4-аминосалициловой кислотой и гидразидом изоникотиновой кислоты: автореф. дисс. … канд. хим. наук. Уфа,2007. 27 с.
5. Бадыкова Л.А., Мударисова Р.Х., Борисов И.М., Монаков Ю.Б. Модификация природного полисахарида арабиногалактана ампициллином // Химия и технология растительных веществ: тез. докл. IV Всеросс. научн.конф. Сыктывкар, 2006. С. 29.
6. Коптяева Е.И., Мударисова Р.Х. Синтез комплексов арабиногалактана сибирской лиственницы и его окисленных фракций с йодом // Химия и медицина: тез. докл. VI Всеросс. научн. семинара. Уфа, 2007. С. 171.
7. Patent №6011008 (USA) Drug conjugates with oxidized arabinogalactan or dextran / A.J. Domb, S. Benita,I. Polachek, G. Linden / 2000. CA 2000. V. 132, P. 69331.
8. Nogawa M., Akaike T., Maruyama A. Polyethylenimine/arabinogalactan conjugate as a hepatocyte specific gene carrier// S.T.P. Pharma Sciences. 2001. V. 11. №1. P. 91–102.
9. Assam T., Eliyahu H., Shapira L., Linial M., Barenholz Y., Domb A.J. Polysaccharide-oligoamine based conjugates for gene delivery // Journal Med. Chem. 2002. V. 45. №9. P. 1817–1824.
10. Ehrenfreund-Kleinman T., Azzam T., Falk R., Golenser J., Domb A.J. Synthesis and characterization of novel water soluble amphotericin B – arabinogalactan conjugates // Biomaterials. 2002. V. 23. №5. P. 1327–1335.
11. Josephson L., Rutkowski J.V., Paul K., Frugo T., Groman E.V. Antiviral activity of a adenine-9-β-Darabinofuranoside-5'-monophosphate and a 9 kDa fragment of arabinogalactan // Antiviral Therapy. 1996. V. 1. №3.P. 147–156.
12. Сухов Б.Г., Александрова Г.П., Ганенко Т.В., Грищенко Л.А. и др. Полисахарид арабиногалактан как перспективная матрица для иммобилизации лекарственных средств // Химия и медицина: тез. докл. VI Всеросс. научн.семинара. Уфа, 2007. С. 95–96.
13. Грищенко Л.А. Металлосодержащие нанокомпозиты на основе арабиногалактана: дисс. … канд. хим. наук. Иркутск, 2007. 158 c.14. Широкова Е.Н. Окисление арабиногалактана под действием пероксида водорода и персульфата калия в водной среде: автореф. дисс. ... канд. хим. наук. Уфа, 2003. 22 с.
15. Мударисова Р.Х., Широкова Е.Н., Бадыкова Л.А., Борисов И.М. и др. Синтез и фармакологическая активность окисленных фракций арабиногалактана лиственницы сибирской (Larix sibirica L.) // Химико-фармацевтический журнал. 2005. Т. 39. №8. С. 23–26.
16. Бадыкова Л.А., Мударисова Р.Х., Толстикова Т.Г., Борисов И.М., Монаков Ю.Б. Модификация поли- и олигосахаридов на основе арабиногалактана 5-аминосалициловой кислотой // Химия природных соединений. 2005.№3. С. 219–222.
17. Мударисова Р.Х., Бадыкова Л.А., Толстикова Т.Г., Александрова Г.П. и др. Модификация арабиногалактана и его окисленных фракций 5-аминосалициловой кислотой // Журнал прикладной химии. 2005. Т. 78. №10.С. 1721–1724.
18. Метелева Е.С., Душкин А.В., Толстикова Т.Г., Толстиков Г.А. и др. Механохимическое получение и фармакологическая активность водорастворимых комплексов арабиногалактана и лекарственных веществ // Химия и медицина: тез. докл. VI Всеросс. научн. семинара. Уфа, 2007. С. 189–190.
19. Дубинская А.М. Превращения органических веществ под действием механических напряжений // Успехи химии. 1999. №68. С. 708–724.
20. Медведева Е.Н., Бабкин В.А., Макаренко О.А., Николаев С.М. и др. Получение высокочистого арабиногалактана лиственницы и исследование его иммуномодулирующих свойств // Химия растительного сырья. 2004. №4.С. 17–23.
21. Патент РФ №2256668. Способ получения арабиногалактана / В.А. Бабкин, Л.Г. Колзунова, Е.Н. Медведева,Ю.А. Малков, Л.А. Остроухова / 2005. БИ. №20. 56 Е.Н. МЕДВЕДЕВА, Н.А. НЕВЕРОВА, Т.Е. ФЕДОРОВА, В.А. БАБКИН И ДР.
22. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and relatedn substances // Analytical Chemistry. 1956. V. 28. №.3. P. 350–356.
23. Федорова Т.Е. Количественная спектроскопия ЯМР 13С, 17О и физиологическая активность гуминовых кислот: автореф. дисс. … канд. хим. наук. Иркутск, 2000. 24 с.
24. Медведева Е.Н., Федорова Т.Е., Ванина А.С., Рохин А.В. и др. Влияние способа выделения и очистки арабиногалактана из древесины лиственницы сибирской на его строение и свойства // Химия растительного сырья.2006. №1. С. 25–32.
25. Антонова Г.Ф., Тюкавкина Н.А. Получение высокочистого арабиногалактана из древесины лиственницы //Химия древесины. 1976. №4. С. 60–62.
26. Karacsonyi S., Kovacik V., Alfoldi J., Kubackova M. Chemical and 13C studies of arabinogalactan from Larix sibiricaL. // Carbohydrate Research. 1984. V. 134. P. 265–274.
